Pekerjaan eksperimental pada transplantasi keratinosit alogenik ke bekas luka tikus putih yang dibuat secara artifisial

Keinginan untuk menggunakan potensi seluler dan kebutuhan untuk mencari metode efektif baru untuk memperbaiki tampilan estetika bekas luka menyebabkan gagasan untuk mencoba kemungkinan transplantasi keratinosit pada permukaan parut.

Untuk membuktikan kemungkinan penggunaan kultur keratinosit untuk memperbaiki jenis bekas luka, percobaan dilakukan pada tikus laboratorium putih, yang menciptakan permukaan sikatrikial. Model rumen tikus diperoleh sebagai hasil penyembuhan luka artifisial di punggung, di sepanjang tulang belakang. Tikus dipotong dalam potongan kulit yang sama dengan ukuran 2x3 cm. 2,5 bulan setelah operasi pemodelan bekas luka, tikus-tikus itu dermabrasi (pengangkatan lapisan atas rumen dengan bantuan termokopel) dan transplantasi keratinosit allogeneic yang diisolasi dari kulit tikus selama 2-4 hari. Setelah lahir

Isolasi dan pertumbuhan epidermosit tikus dilakukan di laboratorium teknologi seluler Institut Rasio Sitologi dari teknologi berikut.

Kulit dicuci dengan larutan Hanks saline yang mengandung gentamisin 200 U / ml, dipotong kecil-kecil dengan luas 0,2-0,5 cm ². Kubus kulit diinkubasi dalam larutan desaspase 0,5% dalam larutan penyangga fosfat salin seimbang pada suhu 37 ° C selama satu jam. Potongan-potongan itu kemudian dipindahkan ke garam penyangga fosfat Dulbecco dan epidermis dipisahkan dari dermis. Epidermis diinkubasi dalam larutan tripsin 0,125% selama 10-15 menit dengan pengadukan pada 50 rpm, setelah itu tindakan enzim dihentikan dengan penambahan serum janin bovine 5%. Sepertiga dari suspensi sel yang diperoleh digunakan dalam bentuk murni untuk salah satu varian transplantasi menjadi bekas luka, sepertiga ketiga ditanam pada lapisan film domestik biokompatibel "Polipor", piring Petri ketiga tanpa substrat. Operasi dermabrasi bekas luka yang didapat pada tikus dengan transplantasi epidermosit tikus berikutnya dilakukan dengan anestesi eter menggunakan kautaskan panas.

Kelompok pertama dari tikus setelah dermabrasi pada dipoles, dicuci dengan saline dan permukaan kering rumen steril ditumpangkan potongan rumput, yang disimpan bergegas bubur tikus alogenik epidermotsitov pada konsentrasi 1,5 juta sel per 1 ml (menurut Institut Sitologi). Potongan batistovye pas di bekas luka yang dipoles sehingga sel-sel terbaring di permukaan bekas luka. Perban beberapa lapis kasa dijahit di atas, yang dijahit di tepi bekas luka.

Bagian dari suspensi sel yang dihasilkan dilapisi pada piring Petri pada film Polypore steril yang dipotong dalam bentuk cangkir, bagian lainnya dari masakan Petri tanpa film. Budidaya dilakukan dalam medium FAD yang terdiri dari campuran DMEM dan F12 dengan perbandingan 3: 1. Dengan penambahan serum bovine 10% janin, 5 μg / ml insulin (Sigma), 0,5 μg / ml hidrokortison hemisuksinin (Sigma). 10 μg / ml faktor pertumbuhan epidermal EGF (Institute of Cytology RAS, St. Petersburg). Kelompok tikus kedua dan ketiga dengan 7 individu dioperasikan 6 hari setelah hari pertama. Pada saat ini, strata multilayer terbentuk dari suspensi keratinosit yang ditabur di piring petri, yang ditransplantasikan ke tikus. Kelompok kedua ditransplantasikan dengan epidermosit pada film, kelompok ketiga - dengan lapisan berlapis-lapis tanpa substrat. Setelah 7 hari, lapisan keratinosit alogik berlapis-lapis (MPALK) berlapis-lapis pada film Polypore, ditransplantasikan oleh kultur langsung ke permukaan luka. Di atas, film tersebut, untuk menghindari rippingnya, diperbaiki dengan saus kasa berlapis multilayer dan dijahit ke kulit tikus.

Sebelum transplantasi keratinosit, kelompok ketiga tikus yang tumbuh tanpa substrat dipisahkan dari dasar cawan Petri dengan perawatan dengan disposisi yang memiliki kemampuan untuk mematahkan ikatan dermo-epidermal secara selektif. Ketika terpapar lapisan berlapis-lapis, disaspase menghancurkan sambungan sel lapisan basal ke dasar cawan Petri dan pada tingkat yang jauh lebih kecil mempengaruhi ikatan interselular, yang memungkinkan untuk "melepaskan" lapisan seluruhnya. Detasemen lapisan sel berlipat ganda dengan disposisi dilakukan sebagai berikut. Media pengangkutan dikeringkan dari cawan Petri, lapisan sel dicuci tiga kali dengan media nutrisi yang mengandung antibiotik, khususnya gentamisin (0,2 mg / ml). Tempat tidur berlapis-lapis dituangkan ke dalam larutan dyspase ("Sigma" 0,125%) dan ditempatkan di termostat di mana mereka diinkubasi pada t = 37 ° C selama 20-30 menit. Munculnya corolla putih yang mengelupas di pinggiran formasi merupakan indikasi awal proses pemisahan itu dari tepi dan bawah cawan Petri. Beberapa menit setelah permulaan proses pemisahan, larutan disaspase digabungkan, lapisan epitel dicuci 2-3 kali dengan media. Di permukaan lapisan epidermis, sepotong perban luka steril "Lita-warna, yang dilekatkan lapisan terpisah, ditambahkan, dipotong secara spasial dari bagian bawah cangkir dengan spatula." Dengan bantuan pinset mata, lapisan itu bersama lapisan serbet "Lita-color" (Rusia ) terlepas dari dasar cawan Petri dan dengan hati-hati dipindahkan ke permukaan rumen yang telah disiapkan. Tisu "Lita-color" mengandung gentamicin dan exoline (ekstrak kolagen), yang bila dibasahi dengan sisa media pertumbuhan dan jauh Shem larutan garam membengkak dan menjadi pelapis luka modern yang memberikan perlindungan yang baik dari infeksi eksternal dan penyembuhan cepat karena pembasahan yang baru jadi dengan struktur.

Film poliprop dan serbet warna Lita dilapisi dengan perban kasa yang dijahit ke kulit tikus agar fiksasi lebih awet. Setiap tikus ditanam di kandang yang terpisah, untuk menciptakan kondisi optimal untuk pemeliharaan dan penanganan keratinosit yang ditransplantasikan. Pembalutan tikus, yang ditransplantasikan dengan suspensi dan lapisan epidermosit berlapis-lapis, dilepas dengan disposisi, dibasahi setiap hari beberapa kali sehari dengan larutan garam steril, untuk menciptakan kondisi yang paling menguntungkan untuk penyerapan sel. Mengingat bahwa film "Polypor" itu kedap air, tikus dari kelompok kedua tidak membasahi dressing, yang merupakan salah satu kelebihan daripada transplantasi tanpa film. Setelah 10 hari, perbannya dilepas. Gambaran klinis bekas luka setelah transplantasi sel sedikit berbeda dari bekas luka tanpa transplantasi, kecuali pewarnaan yang lebih merah muda (karena dermabrasi) dan pengelupasan yang lebih besar. Fakta ini menunjukkan hal itu. Segera setelah lenyapnya penutup luka dengan IPC, tidak ada perubahan yang terjadi pada rumen.

Mengambil bahan biopsi pada tikus.

Setelah 1, 2, 5 dan 9 bulan setelah pengalihan keratinosit alogik tikus ke bekas luka tikus putih, bahan tersebut diambil untuk pemeriksaan mikroskopis histologis, sitomfologi dan elektron. Sebagai contoh kontrol kulit tikus normal dan bekas luka diambil tanpa transplantasi sel. Anestesi pada tikus dilakukan dengan anestesi eter.

Setelah anestesi, dari daerah yang ditandai, di mana keratinosit ditransplantasikan, pelukis biopsi dengan diameter 2 mm. Potongan-potongan jaringan parut diambil dan ditempatkan dalam larutan glutaraldehida 2,5% untuk menyiapkan bahan mikroskop elektron. Potongan jaringan yang diambil untuk pemeriksaan histologis ditempatkan dalam larutan formalin netral 10%, diikuti oleh pengkabelan melalui roh dan dituangkan ke dalam parafin, diikuti dengan memotong bagian ultra tipis dan melihatnya di mikroskop optik ringan.

Kontrol I. Kulit tikus normal.

Untuk melihat perbedaan antara gambaran mikroskopis dari tikus dan bekas luka bekas luka yang normal pada waktu-waktu tertentu setelah transplantasi, foto dan deskripsi IPC pada semua tahap penelitian ini ditunjukkan.

Epidermis kulit normal terdiri dari 7-9 lapisan sel. Lapisan tebal ketebalan sedang. Di tempat itu terdiri dari 6-8 lapisan sisik horny. Lapisan basal diwakili oleh sel-sel berbentuk silinder dengan cahaya besar, nukleus biasa dan beberapa nukleol. Desmosomal koneksi antara sel dan membran basal dengan jelas diekspresikan. Di bawah membran basal yang ditandai dengan baik, yang memiliki pertumbuhan kecil di lapisan subepidermal, sejajar dengannya terdapat kumpulan serat kolagen dan elastin yang halus, di antaranya bentuk fibroblas memanjang, pembuluh darah kecil. Di lapisan yang lebih dalam, kumpulan serat kolagen dan elastin terletak pada arah yang berbeda. Diantaranya ada banyak pembuluh dengan dinding tipis dari kaliber yang sama, elemen seluler (fibroblas, sel mast, leukosit). Dalam sejumlah besar folikel rambut, kelenjar sebaceous.

Kontrol 2. Bekas tikus berumur 2 bulan.

Gambaran klinis. Guratan merah muda pucat, dengan mengupas, di tempat kerak tetap. Daerah mereka menurun karena kontraksi serat kolagen dan menjadi sekitar 3,0-3,5 cm ^:. Keterikatan kulit tidak ada.

Gambar mikroskopis Epidermis terdiri dari 3-5 lapisan sel, dilipat, diwakili oleh sel basal berbentuk bulat, satu baris diikat, 1-2 baris granular dengan butiran keratogialin di lapisan atas, ada bagian edema intraselular. Lapisan kornea berubah secara heterogen dari yang sangat tipis menjadi menebal. Ada lipatan rumen karena (kontraksi) jaringan parut. Lipatan menembus lapisan papiler dan memberi kesan papilla. Batas antara epidermis dan dermis adalah garis lurus. Membran basal tidak dapat ditelusuri di mana-mana. Di bagian bawah lapisan subepidermal dan dalam - pembuluh dengan dinding yang tebal dan kendur, banyak yang sepi, dengan fenomena stasis. Di sekitar kapal - sekelompok makrofag, fibroblas. Makrofag mengelilingi eritrosit yang muncul dari kapiler dan mengkhagositosisnya. Di lapisan yang lebih dangkal - kapiler kecil. Di bawah epidermis, serat kolagen longgar. Di lapisan yang lebih dalam dari kumpulan serat kolagen rumen - kasar ada banyak fibroblas.

Jaringan parut tikus sebulan setelah transplantasi keratinosit tikus tikus MPAl.

Gambaran klinis. Bekas luka merah muda, daerahnya menurun, terutama dengan diameter dan rata-rata 2,5-3 cm ². Kelenjar rambut dan sebaceous tidak ada.

Data pemeriksaan mikroskopik terhadap bahan yang diperoleh dari tikus dengan transplantasi MPALK pada film dan MPALK tanpa substrat praktis identik. Namun, pekerjaan teknis murni dengan MPALK tanpa substrat jauh lebih rumit dan melelahkan daripada saat mengembangkan MPALK pada substrat, oleh karena itu, dalam studi lebih lanjut tentang pertanyaan tentang transplantasi inokulum korta ke dalam bekas luka, kami menggunakan dasar untuk mengembangkan cabor ("substrat" berlapis substrat).

Gambar mikroskopis Ada penebalan epidermis sampai 15-20 lapisan, hampir sampai tengah keratinosit memiliki bentuk vertikal yang sempit, memanjang, dan susunan yang kompak. Sel basal disusun dalam garis yang tidak rata. Nuklei mereka ringan, besar, bulat bentuknya dengan satu atau dua nukleolina, yang mengindikasikan aktivitas sintetis dan proliferatif tinggi mereka. Batas antara epidermis dan dermis adalah garis lurus. Lapisan berduri ini berkembang dengan baik, terdiri dari 3-5 lapis sel berbentuk bulat, ada 2 sel nukleolus.

Segera di bawah membran basal - bundel tipis kolagen serat kolagen yang sempit, sejajar dengan sejumlah besar bejana kosong, serat kolagen yang lebih dalam lebih kasar, dikumpulkan dalam kumpulan padat. Banyak fibroblas besar, sel mast (2-3 di bidang penglihatan), makrofag, leukosit dan pembuluh kosong, dindingnya dilonggarkan, di sekitarnya terdapat serabut kolagen yang terletak longgar. Pada beberapa pembuluh - stasis, diapedesis elemen seragam. Sekitar pembuluh - fibroblas, limfosit tunggal. Keterikatan kulit tidak ada.

Bila suspensi keratinosit ditransplantasikan ke bekas luka yang dipoles, gambaran mikroskopik berbeda dari yang sebelumnya. Pada kebanyakan hewan - epidermis tipis, terdiri dari 5-6 lapisan sel. Lapisan bawah terdiri dari sel bentuk poligonal yang tidak beraturan dengan nuklei berbentuk bulat yang tidak beraturan. Kondisi lapisan subepidermal serupa dengan kelompok hewan tanpa transplantasi.

Dalam kasus ini, seseorang dapat berbicara baik menunda proses yang menyertai transplantasi sel, atau kehilangan sel besar yang ditransplantasikan dalam bentuk suspensi. Oleh karena itu, sebuah kesimpulan dibuat bahwa koreksi jaringan parut oleh transplantasi keratinosit dalam bentuk suspensi tidak dianjurkan.

Jaringan parut tikus 2 bulan setelah transplantasi keratinosit tikus tikus MPAl.

Gambaran klinis. Bekas luka itu terlihat kurus, empuk. Di tempat ada ecdysis, timbangan.

Gambar mikroskopis Stratum korneum menebal, di tempat - hiperkeratosis. Epidermis menebal, terdiri dari 12-20 baris sel. Batas antara epidermis dan dermis adalah garis lurus. Serabut kolagen halus di bawah epidermis cukup erat. Pada lapisan rumen yang lebih dalam, mereka dikumpulkan dalam bundel besar yang kasar. Di lapisan subepidermal, formasi baru pembuluh darah muncul. Di lapisan bawah jaringan parut - banyak pembuluh darah kosong, yang terletak sejajar dengan permukaan epidermis. Fibroblas besar didistribusikan secara merata dalam ketebalan rumen, ada banyak makrofag raksasa, multifaset.

Jaringan parut tikus 5 bulan setelah transplantasi MP spermatogram tikus.

Gambaran klinis. Bekas luka terlihat halus, mulus tanpa mengelupas, ada bulu tunggal, kerapatannya lebih besar di pinggiran bekas luka, yang mengindikasikan pertumbuhan marjinal folikel rambut ke dalam bekas luka dan pembentukan folikel rambut. Area bekas luka terus menurun.

Gambar mikroskopis Epidermis masih tebal (15-20 lapisan, kadang sampai 30) di lapisan atas diisi dengan butiran keratogialin. Membran basal terlihat jelas. Di bawah serabut kolagennya terbengkalai. Di lapisan bawah - kolagen lebih kuat dan rapat. Di antara balok kolagen ada banyak kapiler. Di lapisan atas jumlah kapal kosong menurun. Epidermis dan dermis sedikit bergelombang. Ada pertumbuhan epidermal dalam jaringan parut. Di antara serat kolagen terlihat pembuluh yang baru terbentuk. Muncul folikel rambut tunggal dan kelenjar sebaceous.

Jaringan parut tikus 9 bulan setelah transplantasi epidemiosit tikus IPA.

Gambaran klinis. Bekas luka menjadi jauh lebih kecil dibandingkan dengan kondisi awal, rata-rata area sekitar 1,5-2,0 cm ². Bekas luka tidak rata ditutupi rambut tipis, terutama di sekitar pinggiran. Penskalaan pelat kecil kecil dipertahankan.

Gambar mikroskopis

Epidermis menjadi lebih tipis, diwakili dari 6-8 baris sel, yang mengingatkan pada struktur epidermal kulit normal tikus, hanya kepadatan sel sebesar 1 mm. Lebih tinggi dan lebih kecil. Lapisan basal terdiri dari sel kecil berbentuk silinder bundar. Membran basal didefinisikan dengan baik, hemidesmosom terlihat jelas. Kehadiran pertumbuhan epidermal di lapisan subepidermal dicatat. Lapisan papiler diekspresikan sepanjang seluruh bekas luka. Fakta-fakta ini menunjukkan bahwa untuk jangka waktu ini adhesi keratinosit yang ditransplantasikan telah menjadi lebih kuat secara signifikan dengan jaringan rumen di bawahnya. Akibatnya, perawatan untuk bekas luka orang dengan transplantasi MALC 9 bulan setelah transplantasi IPC bisa menjadi tradisional. Di bawah epidermis serat kolagen lebih halus daripada lapisan dalam. Ada banyak kapal, terutama di sebelah kanan. Di kapal yang lebih besar, dindingnya menebal. Folikel rambut dan kelenjar sebaceous dalam jumlah banyak. Pola mikroskopis menyerupai jaringan dermal.

Hasil karya eksperimental dan diskusi mereka.

Dalam perjalanan kerja ini, keratinosit ditransplantasikan dalam berbagai bentuk pada bekas luka kulit buatan tikus, setelah operasi dermabrasi, pada penutup luka, sebagai suspensi pada batiste dan lapisan berlapis-lapis tanpa substrat. Pekerjaan dilakukan untuk mendapatkan data morfologi tentang efek keratinosit alogenik yang ditransplantasikan pada bekas luka, serta menentukan varian transplantasi optimal.

Ditemukan bahwa ketiga metode transplantasi itu nyata, namun transplantasi IPAA tanpa substrat adalah prosedur yang sangat sulit, dimana IPAC dapat terluka, yang mempengaruhi hasil transplantasi. Selain itu, metode transplantasi ini tidak termasuk bekerja pada permukaan yang besar.

Transplantasi suspensi keratinosit adalah metode yang jauh lebih ekonomis, tidak memerlukan kultur sel yang panjang, dan sederhana dalam versi yang kami usulkan menggunakan billet kambrik steril yang ukurannya sesuai dengan ukuran bekas luka. Kelemahan efek terapeutik selama transplantasi suspensi sel selama sekitar satu bulan dibandingkan dengan MIC pada lapisan luka bukanlah momen penting dengan durasi pengobatan, yang dihitung dalam beberapa bulan. Diketahui bahwa selama transplantasi IPC untuk membakar pasien, transformasi struktur kulit terjadi secara bertahap dan selama beberapa tahun. Transplantasi kultur keratinosit pada penutup luka adalah metode yang paling mudah dan menjanjikan, namun harganya jauh lebih mahal. Selain itu, untuk saat ini membutuhkan lapisan yang lebih canggih yang harus bersifat plastik, higroskopik, memiliki sifat bakteriostatik atau bakterisida dan secara biologis netral untuk sel. Polypore film - sebuah varian antara lapisan luka film dalam negeri, meskipun beberapa ketidaksempurnaan, memungkinkan kita untuk belajar dalam percobaan transplantasi keratinosit tikus menjadi bekas luka dan menarik kesimpulan tentang keefektifan arah ini dalam penyembuhan bekas luka.

Penulis yang melakukan transplantasi IPC pada luka bakar mencatat bahwa selama minggu pertama setelah transplantasi lapisan keratinosit berlapis-lapis pada luka yang disenyapkan, epidermis menebal dan bertingkat. Semua lapisan epidermis didefinisikan dengan baik. Sangat menarik bahwa jumlah lapisan sel dalam transplantasi 10-30% lebih besar daripada spesimen biopsi kulit. Para penulis mencatat munculnya butiran keratogialin pada hari ke 5 setelah transplantasi MPA, membran basal dan hemidesmosom - sudah pada hari ketiga.

J.Rives et al. (L994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM et al. (1998) menemukan bahwa pada periode awal setelah transplantasi BMD ke pasien dengan defek kulit penuh ketebalan setelah luka bakar, hubungan antara dermis dan epidermis sangat lemah dan mewakili garis lurus, lapisan papiler tidak ada. Pada akhir bulan kedua, pembentukan papila dan pelengkap dangkal kulit dimulai, hubungan antara dermis dan epidermis menjadi lebih awet. Data literatur berbicara tentang transplantasi keratinosit alogenik pada luka pasien yang terbakar, sebagai metode yang menjanjikan. Terlepas dari kenyataan bahwa penolakan keratinosit alogenik terjadi oleh penulis yang berbeda dalam periode dari 10 hari sampai 3 bulan, namun demikian mereka memenuhi peran mereka dalam penyembuhan permukaan luka, mengisolasi faktor pertumbuhan dan menutup secara mekanis defek. Dipercaya bahwa MPALK memiliki aktivitas antigenik yang berkurang, karena selama penanaman in vitro, sel Langerhans hilang, yang memungkinkannya ada sejak lama dalam organisme penerima. Selain itu, kultur allogeneic yang diperoleh dari kulit orang muda yang sehat memiliki potensi biologis yang jauh lebih besar daripada budaya autologous pasien setelah trauma.

Tujuan utama penelitian kami adalah untuk mengetahui apakah keratinosit alogenik akan bertahan pada bekas luka dan apa perubahan jaringan bekas luka di bawah pengaruh lapisan luka biologis yang aktif secara biologis. Jika terjadi hasil yang positif, lakukan teknologi paling efektif dan paling padat tenaga kerja di bidang rehabilitasi ini.

Data yang kami dapatkan dalam banyak hal ternyata serupa dengan data literatur tentang perubahan morfologi yang terjadi pada epidermis manusia setelah pengalihan keratinosit alogenik untuk membakar luka. Namun ada perbedaan yang signifikan, baik dari segi substrat morfologi, yang ditransplantasikan, maupun dalam hal teknologi. Jadi proses pembentukan membran basal dan koneksi dermo-epidermal (hemidesmosomes, papillae) terjadi di kemudian hari daripada di transplantasi keratinosit ke permukaan luka tanpa perubahan bekas luka. Hal ini tampaknya disebabkan oleh gizi buruk jaringan rumen dibandingkan dengan dermis atau fasia otot. Bekas luka, terutama yang tua, adalah jaringan ikat padat dengan jumlah kapal yang sangat sedikit, bagian bawah luka bakar adalah jaringan granulasi yang kaya akan pembuluh darah. Dengan demikian, jelas bahwa kondisi dimana transplantasi dan pengharutan keratinosit terjadi sama sekali berbeda. Semakin vascularized area transplantasi sel, semakin mudah memprosesnya. Dari dalil ini ada kesimpulan tentang preferensi untuk bekerja dengan bekas luka muda, di mana jaringan ikatnya masih cukup longgar dan kaya akan pembuluh darah.

Sebagai hasil dari karya eksperimental ini, terbukti bahwa:

1. Transplantasi MALK ke bekas luka adalah mungkin. 
2. Metode optimal untuk transplantasi adalah transplantasi keratinosit pada penutup luka.
3. Permukaan bekas luka harus digiling menggunakan dermabrasion operasi dengan menggunakan laser Schumann atau pemotong.
4. Di bawah pengaruh MPALK, epitelisasi cepat permukaan tanah rumen terjadi.
5. Jaringan parut vaskularisasi yang lebih baik, yaitu bekas luka yang lebih muda, semakin baik hasil transplantasi keratinosit.
6. Jaringan parut di bawah pengaruh keratinosit yang ditransplantasikan secara berangsur-angsur berubah dan berubah menjadi jaringan parut seperti kulit (lebih rapuh dengan pelengkap kulit).
7. Kelonggaran bertahap jaringan parut dimulai dengan lapisan subepidermal. Memperbaiki vaskularisasi, kumpulan serat kolagen di bagian atas dan bawah rumen mengambil lokasi yang lebih gembur daripada di jaringan parut tanpa transplantasi sel. Ada folikel rambut dan kelenjar sebaceous. Epidermis dalam strukturnya, setelah melewati fase hipertrofi, mendekati epidermis kulit normal.
8. Perubahan yang diamati dikaitkan dengan faktor pertumbuhan yang diturunkan keratinosit, sitokin, yang memperbaiki trofisme jaringan parut dan memfasilitasi transformasi dari jaringan fibrosa kasar ke jaringan yang lebih gembur, yang menyebabkan peningkatan penampilan bekas luka.

Dengan demikian, berdasarkan penelitian ini, dapat disimpulkan bahwa efek menguntungkan dari keratinosit yang ditransplantasikan pada jaringan parut, yang mungkin sangat penting untuk rehabilitasi pasien dengan berbagai jenis bekas luka.

Ini bekerja pada tikus juga memungkinkan untuk merumuskan persyaratan. Untuk penutup luka, di mana keratinosit tumbuh.

Penutup luka harus:

• biokompatibel dengan sel,
• bernapas,
• memiliki dasar bentuk bangunan yang elastis,
• menjadi hidrofilik,
• Sebagai aditif obat mengandung obat antibakteri dan antioksidan yang tidak beracun bagi sel kultur.

Hasil klinis dari perawatan bioteknologi bekas luka.

Sebelumnya, N. Carver et al. (1993) menemukan bahwa dressing oklusif paling baik untuk melekat pada luka dan kelangsungan hidup keratinosit, namun tidak memungkinkan pembentukan epidermis bertingkat (dewasa). Untuk membentuk epidermis bertingkat, diperlukan lingkungan udara. Oleh karena itu, setelah menempelkan lapisan berlapis-lapis, penutup luka oklusif disarankan setelah 7-10 untuk mengeluarkan dan melakukan luka di bawah perban kering atau salep yang larut dalam air. Kita dapat mengatakan bahwa kualitas dan sifat "substrat" di mana sel-sel tumbuh sangat penting untuk efektivitas transplantasi bahan seluler, dan akibatnya untuk hasil kerja para dokter. Tapi tidak ada luka ideal yang menutupi saat ini, terlepas dari banyaknya pilihan yang diajukan (kulit buatan, kain non-woven dari karboksimetilselulosa, lapisan fibrin, film poliuretan semipermeabel). Bukan momen yang tidak penting dalam hal ini adalah biaya "substrat" (pelapis luka khusus), karena biaya tinggi mereka meningkatkan total biaya pengobatan bioteknologi.

Efektivitas teknologi seluler telah terbukti sampai saat ini, namun sayangnya, teknologi ini sangat mahal, terutama di negara-negara di mana produksi produksi komposisi seluler tidak terbentuk. Namun demikian, negara-negara seperti Amerika Serikat telah lama mendirikan industri untuk produksi bahan seluler untuk transplantasi terbakar. Secara khusus, BioSurface Technology Inc, sejak tahun 1989, telah mengembangkan 37.000 lapisan keratinosit berlapis-lapis yang telah digunakan untuk merawat 240 pasien di 79 negara (R.Odessey, 1992) dengan 1 cm ² kultur sel berharga sekitar 7-8 $ US.

Teknologi mengobati berbagai penyakit dan masalah kulit memiliki sejumlah perbedaan, namun di jantung pengobatan dengan sel adalah produksi bahan sel berkualitas dan transplantasi.

Proses ini terdiri dari langkah-langkah berikut:

• Pemilihan kulit dari yang terkena (atau dari donor),
• pengangkutan lipatan kulit ke pusat bioteknologi,
• isolasi sel dari lapisan basal dan multiplikasi mereka,
• membangun lapisan berlapis berlapis berlapis keratinosit (IPC).
• transplantasi kultur sel.

Masalah utama dalam pengobatan dengan transplantasi strata keratinosit berlapis adalah kebutuhan akan sel yang layak pada semua tahap transplantasi sel. Potongan kulit untuk mengisolasi sel autologous atau allogeneic harus setipis mungkin, karena dalam kasus ini mereka lebih mudah dipisahkan dengan menggunakan metode mekanis dan enzimatik dan untuk mendapatkan suspensi sel hidup untuk pertumbuhan. Mereka bisa didapat dengan memotong dermatom atau menggunakan kulit kelopak mata, kulup, permukaan bagian dalam bahu. Mengingat bahwa sel-sel tersebut peka terhadap halogen (klorin, yodium), hidrogen peroksida, mereka tidak dapat digunakan dalam perawatan kulit pada saat pengambilan bahan.

Hasil kuantitatif dan kualitatif sel dari cangkokan kulit dan keefektifan budidaya mereka juga bergantung pada status kesehatan dan usia donor. Selain itu, spesimen biopsi kulit harus dikirim ke laboratorium sesegera mungkin dan dalam kondisi yang sesuai (lingkungan, suhu) dikirim ke laboratorium bersertifikat dan terakreditasi.

Medium atau medium elek 199 dengan penambahan serum bovine 10%, medium DMEM dilengkapi dengan serum janin bovine 5% dan antibiotik dapat digunakan untuk menyimpan dan mengangkut lipatan kulit.

Di laboratorium sitologi, biopsi kulit pertama-tama dibagi secara mekanis menjadi potongan-potongan kecil, kemudian pengolahan fragmen kulit dilakukan dengan bantuan enzim: tripsin, kolagenase, dyspase, dll.

Di bawah aksi enzim, penghancuran oleh desmosom terjadi dan keratinosit dilepaskan ke dalam medium sebagai sel atau agregat terpisah yang terdiri dari sejumlah sel yang berbeda. Untuk kultur, hanya keratinosit basal yang digunakan pada media khusus dalam inkubator yang mengandung CO 5%. Dalam petri dishes atau dalam botol pada t = 37 ° C. Dalam 48 jam, pembentukan koloni keratinosit diamati, yang berangsur-angsur menjadi monolayer. Setelah mendapatkan sejumlah sel yang cukup, suspensi yang dihasilkan tersebar di luka yang disiapkan untuk tujuan ini dan ditempatkan di piring Petri. Dari suspensi, pertama monolayer dan kemudian lapisan keratinosit berlapis-lapis terbentuk. Secara skematis, tahapan proses kultivasi keratinosit ditunjukkan pada Gambar. 12 (33.43.54.65).

Pembentukan formasi keratinosit berlapis multilayer yang sesuai untuk transplantasi biasanya memakan waktu 7-10 hari. Terkadang periode ini lebih panjang, tergantung dari kualitas bahan sumbernya (usia, kesehatan donor, kebenaran material, kualitas media yang digunakan, dll). Jika lapisan berlapis berlipat ganda, maka di permukaannya mungkin ada sel dengan fenomena apoptosis yang tidak sesuai untuk transplantasi. Cawan petri, yang tumbuh di dalamnya pada penutup luka oleh lapisan keratinosit berlapis-lapis (multilayered layers of keratinocytes / IPC), dikirim ke klinik dalam wadah khusus pada suhu yang tidak lebih rendah dari + 15 ° C.

Metode Hijau yang dimodifikasi untuk menumbuhkan IPC

Dalam pekerjaan kami sebagai lapisan luka, kami menggunakan kambrik berlapis banyak, meninggalkan film polipori yang dengannya kami mulai melakukan percobaan dengan tikus. Dengan demikian, strata keratinosit berlapis banyak ditanam oleh kita pada prefat dan batiste steril, meski juga bukan penutup luka yang optimal.

Studi klinis dilakukan pada sukarelawan dengan memperhatikan norma etika yang diperlukan: menandatangani sebuah perjanjian dan informed consent.

1. Budaya sendiri (autologous) dan diambil dari keratinosit sel bank (allogenic) diaplikasikan.
2. Keratinosit sendiri diperoleh dari potongan kulit yang dipotong dari bagian dalam bahu pasien.
3. Pengoperasian dermabrasi bekas luka dilakukan dengan bantuan thermocoupling, disk rotary dan laser erbium.
4. Kelompok pasien dengan bekas luka normotrofik, hipotrofik dan hipertrofik diambil.

Proses teknologi untuk penerapan teknologi seluler untuk memperbaiki jenis bekas luka kulit terdiri dari tahapan sebagai berikut:

1. Pemilihan pasien.
2. Jelaskan esensi perawatan, waktu untuk mendapatkan hasil yang diharapkan, penandatanganan perjanjian dan informed consent.
3. Penunjukan pasien selama 2-3 minggu sebelum operasi selmevit dengan 1t. 3 kali sehari, zinkteral pada 1t. 3 kali sehari
4. Mengambil selembar kulit sepanjang 2,0 cm dan lebar 0,7-1,0 cm dari permukaan dalam bahu, tinggi, hampir di bagian bawah daerah aksila, untuk mendapatkan keratinosit autolog.
5. Jika pasien menolak untuk mengisolasi keratinosit mereka sendiri karena kemungkinan mendapatkan bekas luka linear pada permukaan bagian dalam bahu, bahan selular diambil dari bank sel (keratinosit allogenik).
6. Keratinosit diisolasi dan ditanam dalam kondisi laboratorium yang disertifikasi untuk jenis pekerjaan ini.
7. Setelah menerima IPC yang cukup untuk transplantasi, satu hari operasi diberikan pada bekas luka di klinik, di mana bahan dibawa dalam wadah khusus di piring petri.
8. Pengoperasian dermabrasi rumen, haemostasis dilakukan, permukaan tanah dicuci dengan larutan garam steril, dikeringkan, setelah itu IPC ditransplantasikan pada sel yang steril "sel turun". Artinya, sel yang berada di atas di MIC lebih rendah, bersebelahan dengan permukaan yang dipoles.
9. Film steril ditumpangkan di atas, yang menempel pada kulit dengan perban elastis atau pita elastis Omnifix. Alih-alih film, pelapis luka acuh tak acuh yang mengandung silikon, misalnya Mepitel, Mepiform, pelat gel silikon, juga bisa digunakan.

Setelah 5-7 hari, lapisan film atau silikon dilepaskan. Pada saat ini, semua keratinosit harus merangkak ke bekas luka yang dipoles dan menempel di permukaannya.

10. Lingkungan basah yang dibuat di bawah lapisan film dan silikon secara aktif berkontribusi terhadap hal ini. Pembaptis yang tersisa di bekas luka dari titik ini dapat diimpregnasi dengan soda atau gel kitosan. Akibatnya, pada hari ke-2, kerak padat dibuat, yang, untuk kenyamanan pasien, lebih baik memperbaikinya dengan plester elastis dan mudah menguap, misalnya Omnifix. Kerak yang bernapas memungkinkan epidermis yang baru dibentuk untuk berdiferensiasi dan berubah menjadi yang matang.

Bergantung pada jenis bekas luka dan kedalaman penggilingan, dressing ditolak setelah 8-10 hari. Epidermis saat ini memiliki lapisan seluler 30-40% lebih banyak daripada kulit normal. Membran basal tidak terbentuk. Keratinosit dari epidermis yang menebal melepaskan molekul biologis aktif ke dalam jaringan parut.

Keberhasilan perawatan bioteknologi bekas luka sangat bergantung pada cara perawatannya pada masa pascaoperasi. Kultur sel adalah jenis luka yang "lembut" dan pada periode awal setelah transplantasi, BMD dapat dengan mudah terlepas dari jaringan di bawahnya. Oleh karena itu, pasien disarankan untuk merawat bekas luka setelah operasi. Selama 8-9 bulan, jangan menggosok dan mudah bekerja dengan air dingin agar tidak merobek epidermis tipis yang baru dibuat yang tidak memiliki pegangan erat dengan jaringan di bawahnya.

Catatan:

Sebelum operasi dan selama penggunaan dermabrasi oksidan terhalogenasi dan pengawet (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, chlorhexidine, hidrogen peroksida) diperbolehkan sebelum tanam kletok- benar-benar kontraindikasi karena efek sitotoksik mereka. Beracun untuk sel juga biru metilen. Hijau cemerlang

Untuk menghindari infeksi, terutama bila bekerja dengan bekas luka hipertrofik, adalah mungkin untuk mengobati medan operasi dengan neomycin sulfate, polymyxin atau gentamicin. Mereka tidak menggunakan efek sitotoksik pada keratinosit.

Sebagai hasil dari perawatan ini, efek triple tercapai.

1. Alignment permukaan rumen.
2. Buat lapisan di atasnya dari epidermis baru, ketebalan normal.
3. Transformasi jaringan parut menjadi seperti dermoid karena aksi sitokin, faktor pertumbuhan dan molekul biologis aktif lainnya, dikeluarkan oleh sel yang ditransplantasikan dan dirangsang oleh mereka keratinosit, fibroblas dan makrofag.

Bekas luka menjadi kurang terlihat, lebih elastis, pori-pori tampak di dalamnya, rambut puff, pigmentasi bisa dipulihkan karena adanya melanosit di MPC.

Namun, semua momen positif di cicatrix ini tidak segera datang. Dalam hal ini, perlu untuk memperingatkan pasien. Bahwa proses transformasi jaringan parut ke dalam dermis lambat dan hasil optimal dari pengobatan tersebut dapat diharapkan tidak lebih awal dari 10-14 bulan. Segera setelah dressing ditolak, permukaan yang dipoles memiliki polikrom yang jelas, proses penggilingan yang lebih terang. Kerusakan paling sedikit pada kulit terjadi saat menggiling bekas luka normotrophic dengan laser erbium. Warna bekas luka dan kulit di sekitarnya dipulihkan pada periode 3 sampai 8 minggu. Meskipun ada tindakan pencegahan semacam itu, terkadang ada hiperpigmentasi pasca operasi, yang dapat berlangsung secara independen selama beberapa bulan.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]