Satu Vial, Dua Target: Diagnosis Tuberkulosis Berbasis CRISPR Portabel dengan Sensitivitas 100%

Sebuah makalah tentang tes tuberkulosis portabel yang dapat dilakukan langsung dari dahak, tanpa peralatan rumit, telah diterbitkan di Science Advances. Amplifikasi DNA isotermal dan pembacaan CRISPR digabungkan dalam satu tabung reaksi; dua insersi M. tuberculosis konservatif (IS6110 dan IS1081) diuji sekaligus, ditambah gen manusia sebagai kontrol sampel internal. Dalam uji "buta" kecil pada sampel klinis, tes tersebut memberikan sensitivitas 100% (6/6) dan spesifisitas 100% (7/7) dibandingkan dengan kultur; batas deteksinya adalah ~69–81 CFU/ml dalam dahak simulasi. Hasilnya dapat dilihat pada strip uji kertas, dan reagennya dibekukan (dibekukan tanpa "rantai dingin").

Latar belakang

Menurut WHO, TB akan membunuh sekitar 1,25 juta orang pada tahun 2023; TB kembali menjadi penyebab kematian menular utama, dengan perkiraan 10,8 juta kasus. Hal ini menjadikan diagnostik yang mudah diakses dan cepat menjadi sangat penting, terutama di wilayah dengan sumber daya terbatas.

• Pengujian yang ada saat ini merupakan kompromi antara akurasi, kecepatan, dan harga. Kultur "standar emas" sangat akurat tetapi lambat; mikroskopi cepat tetapi tidak sensitif; platform PCR seperti Xpert MTB/RIF Ultra secara signifikan lebih sensitif (LOD ≈ 15,6 CFU/ml), tetapi membutuhkan peralatan dan kartrid yang mahal, sehingga membatasi cakupan.
• Mengapa isotermal dan CRISPR? Amplifikasi RPA isotermal bekerja pada suhu 37–42 °C dan tidak memerlukan siklus termal — praktis "di lapangan". Pembacaan CRISPR (Cas12/13) menambah spesifisitas spesies dan memungkinkan aliran lateral visual ("strip") tanpa optik yang rumit. Secara keseluruhan, ini adalah jalur menuju uji PVR yang portabel dan murah.
• Mengapa dua target MBT sekaligus (IS6110 + IS1081). IS6110 adalah sisipan multikopi kompleks M. tuberculosis, tetapi beberapa galur memiliki sedikit salinan, dan tes untuk IS6110 saja mungkin "gagal". Menambahkan sisipan IS1081 kedua mengurangi risiko hasil negatif palsu.
• Mengapa kontrol internal manusia? Sampel napas dapat mengandung inhibitor dan sampel "buruk". Kontrol endogen manusia (misalnya RNase P/DNA genomik) memastikan bahwa material memadai dan reaksi tidak ditekan - jika tidak, hasilnya tidak dapat dianggap negatif.
• Format satu pot itu sendiri penting. Format ini mengurangi langkah, mengurangi risiko kontaminasi, dan memfasilitasi pekerjaan di luar laboratorium. Pendekatan semacam itu untuk TB telah terbukti layak; penelitian baru ini memperluas gagasan tersebut ke format target ganda dengan kontrol internal, serta mendemonstrasikan liofilisasi reagen dan pembaca strip.
• Apa nilai dari artikel ini? Para penulis menunjukkan deteksi langsung dari sputum setelah persiapan sampel yang paling sederhana, batas deteksi sekitar 70–80 CFU/ml dalam sputum simulasi, dan sensitivitas/spesifisitas 100% pada sampel klinis buta kecil — sebuah "demo teknis" yang baik untuk validasi multisenter lebih lanjut.

Bagaimana cara kerjanya?

• Para ilmuwan menggabungkan RPA (amplifikasi isotermal cepat materi genetik pada suhu 37 °C) dengan enzim "pemotong" Cas13a/Cas12a. Setelah memilih RNA pemandu, mereka mengonfigurasi sistem untuk menargetkan dua target MBT secara bersamaan, dan secara paralel dengan DNA manusia (memeriksa apakah ada materi dalam sampel dan reaksinya tidak "macet").
• Semua bahan kimia dimasukkan ke dalam satu tabung reaksi; setelah inkubasi, hasilnya dibaca dengan fluorimeter atau pada strip aliran lateral - pada dasarnya seperti uji ekspres.
• Pengolahan sputum telah disederhanakan menjadi pemanasan dan sentrifus singkat—tanpa ekstraktor asam nukleat. Untuk kondisi yang paling terbatas, para penulis bahkan membahas alternatif manual untuk sentrifus.

Apa yang ditunjukkan oleh tes tersebut

• Batas deteksi: 69,0 CFU/ml (galur H37Rv) dan 80,5 CFU/ml (BCG) dalam sputum "spike". Tidak terdeteksi adanya reaktivitas silang dengan bakteri/jamur lain.
• Pengaturan klinis (sampel tersamar): pada 13 sampel dari praktik nyata - sensitivitas 100% (6/6) dan spesifisitas 100% (7/7) relatif terhadap seeding. Sebagai perbandingan, pada kit yang sama, GeneXpert Ultra menunjukkan 100%/86%, masing-masing.
• Nuansa teknis: dari dua opsi pembacaan, Cas13a bekerja lebih baik (untuk format "satu pot", Cas13a lebih sensitif daripada Cas12a). Selain itu, pengujian paralel dua target Mtb mengurangi risiko hasil yang salah.

Mengapa hal ini perlu?

Tes yang ada saat ini merupakan kompromi antara akurasi, kecepatan, dan ketersediaan: kultur sangat akurat tetapi lambat; usap cepat tetapi tidak akurat; sistem PCR seperti GeneXpert akurat dan cepat tetapi membutuhkan instrumen dan kartrid yang mahal. Pendekatan CRISPR yang baru bertujuan untuk menjembatani kesenjangan tersebut: diagnostik lapangan yang beroperasi pada suhu 37°C, dengan pembacaan strip kertas, dan potensi penyimpanan reagen tanpa pendinginan.

Keterbatasan dan langkah selanjutnya

Ini merupakan demonstrasi awal pada set klinis kecil - diperlukan uji multi-senter yang besar (termasuk koinfeksi HIV, pada anak-anak, dengan bentuk pausibasiler dan berbagai galur MBT). Para penulis secara terpisah mencatat bahwa dalam versi "lapangan" itu sendiri, centrifuge meja harus diganti dengan solusi manual sepenuhnya. Namun, arsitekturnya sendiri - "dua target + kontrol internal" dalam satu tabung reaksi - telah membuktikan operabilitasnya dan menyediakan jalur yang jelas menuju penyempurnaan untuk penggunaan massal.

Sumber: Alexandra G. Bell dkk. Tes berbasis CRISPR yang efisien untuk deteksi tuberkulosis langsung dari dahak, Science Advances, daring 6 Agustus 2025 (Vol. 11, Edisi 32). DOI: 10.1126/sciadv.adx206