Terapi gen nonviral menawarkan harapan untuk nyeri pinggang kronis

Dalam penelitian terbaru yang dipublikasikan di jurnal Biomaterials, para peneliti mengembangkan terapi gen non-viral baru untuk mengobati nyeri punggung diskogenik (DBP) dengan memberikan faktor transkripsi Forkhead Kotak F1 ( FOXF1) menggunakan vesikel ekstraseluler (eEV) yang direkayasa menjadi cakram intervertebralis degeneratif (IVD) secara in vivo.

nyeri pinggang (LBP) kronis adalah masalah global yang berkembang akibat populasi menua dan memburuknya masalah opioid. Perawatan saat ini mencakup pemulihan jangka pendek atau operasi yang mahal, sehingga menyoroti perlunya terapi yang tidak membuat ketagihan dan tidak terlalu invasif.

Terapi biologis saat ini, termasuk pemberian faktor pertumbuhan, terapi sel, dan terapi gen virus, dapat mengurangi degenerasi pada model hewan dan manusia. Namun, kekhawatiran seperti efek jangka pendek, kemanjuran jangka panjang yang buruk, serta imunogenisitas dan tumorigenisitas yang tidak perlu dapat menghalangi penerapan langsung metode ini.

Dalam penelitian ini, para peneliti membuat terapi gen non-viral untuk degenerasi diskus intervertebralis (IVD) menggunakan FOXF1-eEV.

Para peneliti mentransfeksi fibroblas embrio tikus primer (PMEF) dengan plasmid yang mengandung FOXF1 atau pCMV6 sebagai kontrol dan mengkarakterisasi sampel eEV menggunakan uji pelacakan nanopartikel (NTA).

Mereka menilai pemuatan muatan molekuler ke dalam eEV secara efisien menggunakan reaksi berantai transkripsi-polimerase kuantitatif (qRT-PCR) dan PCR konvensional. Analisis Western blot mengidentifikasi FOXF1 dan protein EV spesifik dalam formasi eEV. Tim menggunakan plasmid yang meningkatkan wilayah polylinker hulu dan hilir untuk menentukan keberadaan DNA plasmid FOXF1 dalam sel donor dan menghasilkan eEV.

Mereka memeriksa mRNA full-length yang dihasilkan dari DNA plasmid dalam eEV dan sel donor.

Para peneliti membuat vesikel ekstraseluler dengan faktor transkripsi untuk memulihkan fungsi jaringan dan memodifikasi respons nyeri pada model hewan DBP.

Mereka mengidentifikasi EV untuk mengangkut dan mendistribusikan FOXF1 ke cakram intervertebralis yang rusak pada model tikus dengan nyeri punggung diskogenik untuk menentukan penghambatan FOXF1 eEV pada degenerasi cakram intervertebralis.

Tim ini menggabungkan pengujian biomekanik cakram intervertebralis tikus dengan pencitraan, perubahan matriks ekstraseluler (ECM), dan respons nyeri yang dinilai setelah 12 minggu untuk memastikan perubahan struktur dan fungsi, serta nyeri yang disebabkan oleh intervensi terapeutik.

Penilaian nyeri sebelum operasi dan pasca perawatan meliputi micro-computed tomography (micro-CT), magnetic resonance imaging (MRI), tes mekanis, pewarnaan Alcian blue (AB) dan picrosirius red (PSR), tes dimethylmethylene blue, dan imunohistokimia (IHC) ) ).

Penelitian ini melibatkan teknik pembedahan di mana peneliti menyuntikkan Buprenorfin ER secara subkutan ke tikus untuk mengendalikan nyeri pasca operasi.

Tim melakukan penilaian perilaku sebelum operasi dan setiap dua minggu dari empat hingga dua belas minggu setelah operasi, menggunakan berbagai teknik seperti uji lapangan terbuka, pelat dingin, suspensi ekor, dan suspensi kawat.

Uji lapangan terbuka menilai aktivitas spontan tikus; tes pelat dingin mengukur hiperalgesia termal; Tes suspensi ekor mengukur nyeri aksial; dan uji suspensi kawat mengukur kekuatan.

Dua belas minggu setelah operasi, tim membedah tulang belakang lumbal hewan tersebut, menggunakan penelusuran saraf femoralis dan arteri untuk mengidentifikasi cakram intervertebralis antara L4 dan L5, L5 dan L6, serta L6 dan S1 IVD. Mereka menggunakan IVD L5/L6 untuk mengevaluasi histologi dan menentukan kandungan glikosaminoglikan (GAG).

FOXF1 eEV secara signifikan mengurangi respons nyeri sekaligus memulihkan struktur dan fungsi IVD, termasuk peningkatan tinggi cakram, hidrasi jaringan, kandungan proteoglikan, dan sifat mekanik.

Penelitian ini berfokus pada pelepasan eEV yang memuat FOXF1 dari fibroblas primer yang ditransfeksi dengan faktor transkripsi FOXF1. RT PCR kuantitatif menunjukkan peningkatan yang signifikan pada level transkrip mRNA FOXF1 dan level mRNA FOXF1 transkripsi full-length dibandingkan dengan sel yang ditransfeksi dengan pCMV6.

Terapi FOXF1 eEV dapat mengurangi respons nyeri pada model tikus tusukan cakram lumbal hingga 12 minggu. Tikus betina menunjukkan waktu akuisisi yang lebih lama pada kelompok yang diobati dengan FOXF1 dibandingkan pada kelompok yang terkena lesi, yang berlangsung setidaknya 12 minggu setelah pengobatan.

Terapi FOXF1 eEV meningkatkan hidrasi dan tinggi jaringan IVD pada hewan yang terluka dan degeneratif secara in vivo sambil mempertahankan tingkat hidrasi dan intensitas gambar IVD berbobot T2.

Namun, tim mengamati penurunan tinggi cakram pada hewan yang terluka dan hewan yang diobati dengan pCMV6 eEV. Tikus yang diobati dengan FOXF1 eEV tidak mengalami penurunan tinggi cakram 12 minggu setelah pengobatan. Gender tidak memengaruhi hasil fungsional.

FOXF1 eEV memulihkan fungsi mekanis IVD yang rusak dan mengalami degenerasi secara in vivo. Di bawah tekanan aksial, IVD yang diberi perlakuan FOXF1 eEV menunjukkan kekakuan NZ ternormalisasi yang lebih tinggi dibandingkan dengan IVD yang rusak.

Dalam kondisi mulur, IVD yang rusak menunjukkan peningkatan perpindahan mulur yang dinormalisasi, yang menunjukkan penurunan kekakuan elastis mulur yang dinormalisasi.

Hasil menunjukkan bahwa pengurangan kandungan GAG pada IVD yang rusak meningkatkan fleksibilitas mekanis, namun terapi eEV mencegah hilangnya glikosaminoglikan dan perubahan selanjutnya pada fungsi mekanis.

FOXF1 eEV menyebabkan perubahan struktural dan fungsional pada IVD dengan meningkatkan kadar proteoglikan dan GAG.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa eEV yang mengandung faktor transkripsi perkembangan dapat mengobati penyakit sendi yang menyakitkan seperti DBP dengan mengirimkan faktor transkripsi ini ke sendi IVD yang degeneratif dan nyeri.

Strategi ini dapat membantu mengurangi kelainan struktural dan fungsional yang disebabkan oleh penyakit, serta mengatur respons nyeri spesifik gender.

Para peneliti juga merekomendasikan penggunaan faktor transkripsi perkembangan seperti FOXF1 untuk mengubah sel NP degeneratif menjadi keadaan pro-anabolik in vivo. Diperlukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui efektivitas terapeutiknya.