Model eksperimental osteoartritis

Tulang rawan adalah jaringan yang sangat khusus yang hanya berisi satu jenis sel (chondrocytes), ditandai dengan tidak adanya pembuluh darah dan limfatik. Nutrisi tulang rawan terutama dilakukan dengan penyerapan dari cairan sinovial. Metabolisme chondro-cytes diatur oleh sejumlah faktor yang dapat larut yang diproduksi secara lokal oleh chondrocytes dan jaringan sekitarnya. Fungsi kondrosit juga tergantung pada komposisi media ekstraselular (tekanan oksigen, konsentrasi ion, pH, dll.), Komposisi VCM, interaksi sel dan matriks, sinyal fisik. Tugas utama pemodelan eksperimental adalah penciptaan budaya di lingkungan ekstraselular tanpa mengubah fenotipe sel matang. Tugas kedua adalah menciptakan budaya untuk mempelajari respons kondrosit dini, jangka pendek atau jangka panjang terhadap sinyal kimia dan / atau fisik. Studi in vitro juga memberikan kesempatan untuk mempelajari perilaku kondrosit di osteoarthritis. Tugas ketiga adalah pengembangan sistem co-kuratif, yang memungkinkan mempelajari interaksi berbagai jaringan di sendi. Tugas keempat adalah persiapan implan kartilagin untuk transplantasi berikutnya. Dan, akhirnya, tugas kelima adalah mempelajari faktor pertumbuhan, sitokin atau agen terapeutik yang mampu merangsang perbaikan dan / atau menghambat penyerapan tulang rawannya.

Selama beberapa dekade terakhir, berbagai model budaya sel kartilago artikular telah diciptakan, termasuk budaya monolayer, budaya yang ditangguhkan, budaya chondron, eksplan, cocultures, kultur sel abadi. Setiap budaya memiliki kelebihan dan kekurangan dan masing-masing cocok untuk mempelajari satu aspek metabolisme chondrocyte. Dengan demikian, eksplan cartilaginous adalah model yang sangat baik untuk mempelajari perputaran elemen matriks, yang membutuhkan reseptor permukaan sel asli dan interaksi sel-matriks dan matriks sel normal. Pada saat yang sama, studi tentang deposit dalam matriks atau mekanisme regulasi metabolisme chondrocy dianjurkan dilakukan pada budaya sel yang terisolasi. Kultur low density density monolayer diperlukan untuk mempelajari proses diferensiasi sel. Kultur yang tersuspensi dalam matriks alami atau sintetis adalah model untuk menganalisis respons adaptif kondrosit terhadap tegangan mekanis.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Budaya chondrocyte

Saat memilih jaringan tulang rawan untuk penelitian in vitro, beberapa hal penting perlu dipertimbangkan. Komposisi matriks dan aktivitas metabolik chondrocytes bervariasi pada sendi yang berbeda, dan yang terakhir juga bergantung pada kedalaman chondrocyte dalam jaringan. Data ini diperoleh dalam beberapa percobaan di mana subpopulasi terisolasi dari kondrosit dari zona tulang rawan dari kedalaman yang berbeda dipelajari. Sejumlah perbedaan morfologi dan biokimia ditemukan antara kondrosit yang ada di permukaan dan lapisan dalam tulang rawan artikular. Sel permukaan mensintesis matriks fibrillar proteoglikan yang kadaluwarsa, sementara sel yang lebih dalam menghasilkan matriks yang kaya akan fibril dan proteoglikan. Selain itu, sel permukaan menghasilkan proteoglikan non-agregat yang relatif lebih kecil dan asam hyaluronic dan relatif lebih sedikit aggrecan dan keratan sulfat daripada chondrocytes yang terletak lebih dalam. Fitur pembeda penting lain dari metabolisme kondrosit yang diisolasi dari zona tulang rawan dari kedalaman yang berbeda adalah respons terhadap stimulus eksogen. Menurut M. Aydelotte dan rekan penulis, chondrocytes banteng dari zona permukaan tulang rawan lebih sensitif terhadap IL-1 daripada sel-sel zona dalam.

Perilaku sel juga tergantung pada lokasi jaringan. Chondrocytes tulang rawan tulang rusuk dan telinga, diambil dari hewan yang sama, merespons secara berbeda terhadap faktor pertumbuhan, seperti faktor pertumbuhan fibroblas (FGF) dan TGF-beta. FGF meningkatkan penggabungan timidin, prolin dan leusin ke dalam kultur chondrocyte tulang rusuk, tapi bukan di telinga. TGF-P meningkatkan penggabungan timidin ke dalam chondrocytes tulang rawan tulang rusuk dan telinga, namun tidak mempengaruhi penggabungan timidin dan prolin ke dalam chondrosit telinga. Sel tulang rawan yang diperoleh dari zona yang memiliki muatan terbesar berbeda dengan yang berasal dari situs dengan muatan rendah pada tulang rawan. Dengan demikian, chondrocytes tulang rawan dewasa dari sendi lutut domba dari daerah tengah permukaan artikular tulang lumbal yang tidak ditutupi oleh meniskus, yang membawa muatan terbesar secara in vivo, kurang mensintesis aggrecan, namun lebih banyak decors daripada sel-sel dari daerah yang tertutup meniskus. Para penulis juga menekankan pentingnya penggunaan tulang rawan dari zona sendi identik saat memeriksa fungsi sintetis sendi.

Metabolisme kondrosit dan responsnya terhadap faktor regulasi juga sangat bergantung pada usia donor, perkembangan kerangka dan keadaan persendian dari mana sel diambil. Pada manusia chondrocytes, penurunan yang signifikan dengan usia respon proliferatif diamati. Penurunan terbesar diamati pada donor berusia 40-50 tahun dan lebih dari 60 tahun. Selain itu, tingkat keparahan respons proliferatif terhadap faktor pertumbuhan (misalnya, FGF dan TGF-beta) menurun selama penuaan. Selain perubahan kuantitatif dalam proliferasi kondrosit, ada juga perubahan kualitatif. Sel donor muda (10-20 tahun) merespons faktor pertumbuhan trombosit yang lebih baik (PDGF) dibandingkan dengan TGF-beta, sedangkan yang berlawanan diamati pada sel donor dewasa. Untuk menjelaskan perubahan tergantung usia pada fungsi sintetis chondrocytes dan responnya terhadap pengaruh faktor pertumbuhan, beberapa mekanisme digunakan. Diantaranya, penurunan jumlah dan afinitas reseptor seluler permukaan, perubahan sintesis dan bioaktivitas faktor pertumbuhan dan sitokin, modifikasi sinyal postreceptor.

Kondisi patologis sendi juga mengubah morfologi dan aktivitas metabolik chondrocytes. Jadi, J. Kouri dan rekan penulis (1996) mengidentifikasi tiga subpopulasi kondrosit pada tulang rawan dengan osteoarthritis. Chondrocytes dari dangkal dan bagian atas dari kelompok bentuk tulang rawan dan mensintesis lebih banyak proteoglikan dan kolagen. TGF-beta dan insulin-like growth factor (IGF) mampu merangsang sintesis proteoglikan oleh khondrosit dan menetralkan sebagian efek IL-1 dan TNF-a. Eksplan tulang rawan yang terkena osteoartritis dan kondrosit yang diisolasi dari tulang rawan pasien dengan osteoartritis lebih sensitif terhadap stimulasi TGF-beta dibandingkan dengan kondilastik tulang rawan yang sehat. Perbedaan ini kemungkinan besar terkait dengan perubahan fenotipik pada kondrosit di lapisan atas tulang rawan artikular.

Isolasi chondrocytes individu dicapai dengan pengobatan berurutan dengan enzim proteolitik ECM. Setelah melepaskan diri dari ECM, sel terisolasi sangat ideal untuk mempelajari sintesis komponen matriks de novo. Beberapa penulis hanya menggunakan clostridium collagenase, yang lainnya melakukan pra-inkubasi tulang rawan dengan tripsin, pronase, DNase dan / atau hyaluronidase. Jumlah sel terisolasi bergantung pada enzim yang digunakan. Dengan demikian, saat memproses salah satu dari jaringan kolagenase 1 g dapat diperoleh 1,4T0 ⁶ kondrosit, sedangkan bila menggunakan pronase, hialuronidase dan kolagenase - 4,3-10 ⁶. Saat memproses dengan kolagenase, aggrecan, protein, IL-6, IL-8 tetap berada dalam kultur sel lebih banyak daripada pada kasus pengobatan berurutan dengan berbagai enzim. Ada beberapa penjelasan untuk perbedaan antara dua kultur sel ini:

• Reseptor sel rusak atau dihambat oleh enzim, TGF-beta menghambat DNA dan sintesis proteoglikan pada chondrocytes yang baru diisolasi (hari 1), sedangkan DNA dan sintesis proteoglikan chondrocytes yang dikultur dalam monolayer (7 hari) dirangsang oleh TGF-beta. Namun, untuk mengekspresikan komponen membran ini, diperlukan periode yang memadai sebelum dimulainya percobaan.
• Protein eksogen dapat mematahkan interaksi sel dan matriks, yang dimediasi oleh integrin. Keluarga integrin mempromosikan pelekatan kondrosit ke molekul VKM (Shakibaei M. Et al., 1997). Pecah ini dapat mempengaruhi ekspresi gen matriks.
• Residu komponen matriks dapat mengatur fungsi sintetis chondrosit. Integrin mampu mengenali produk degradasi ECM, sehingga memainkan peran penting dalam perbaikan jaringan setelah terpapar enzim proteolitik. T. Larsson dan rekan penulis (1989) melaporkan bahwa penambahan pro-theoglycans utuh atau terfragmentasi ke kultur sel merangsang sintesis protein dan proteoglikan. Namun, tingkat asam hialuronat yang tinggi menyebabkan penurunan yang signifikan dalam penyertaan sulfat dalam sintesis proteoglikan oleh kondrosit embrio ayam, chondrocytes dewasa babi, dan sel chondrosarcoma tikus. Selain itu, asam hyaluronic adalah penghambat pelepasan proteoglikan dari sel bahkan di hadapan IL-lb, TNF-a, FGF, yang mengindikasikan ketahanan terhadap aktivitas biologis pertama dari faktor pertumbuhan dan sitokin. Mekanisme yang tepat yang mendasari tindakan asam hialuronat tetap tidak jelas; Diketahui bahwa chondrocytes mengandung reseptor untuk asam hialuronat, yang terkait dengan filamen aktin sitosol. Pengikatan asam hyaluronic ke reseptornya merangsang fosforilasi protein. Dengan demikian, data ini menunjukkan modulasi fungsi metabolik chondrocytes oleh molekul protein matriks terfragmentasi atau asli dengan mengaktifkan sel reseptor membran.
• Stimulasi cepat oleh enzim sintesis protein matriks oleh kondrosit dapat menjadi konsekuensi dari perubahan bentuk kondrosit dan / atau reorganisasi sitoskeleton.
• Beberapa sitokin (misalnya, IL-8) dan faktor pertumbuhan (misalnya, IGF-1, TGF-P) diperbaiki di ECM. Contoh yang paling terkenal adalah pengikatan TGF-beta dengan decore, yang menyebabkan penurunan kemampuan mantan untuk menginduksi pertumbuhan sel ovarium pada hamster China. Data bahwa isi dekorasi kartilago meningkat seiring bertambahnya usia, mengindikasikan penurunan bioavailabilitas TGF-beta pada penuaan. Faktor pertumbuhan dan sitokin dapat dilepaskan dari residu matriks selama kultur dan kemudian memodulasi fungsi chondrocyte.

[8], [9], [10], [11],

Kultur monolayer kondrosit

Fenotip diferensiasi khondrosit terutama ditandai oleh sintesis kolagen tipe II dan proteoglikan spesifik jaringan, serta tingkat aktivitas mitosis yang rendah. Ada bukti bahwa dengan berkultivasi sel yang berkepanjangan dalam monolayer, dan setelah beberapa bagian sel yang berulang, kondrositnya kehilangan garis spherical mereka, mendapatkan bentuk seperti fibroblas yang memanjang. Dengan metaplasia fibroblast ini, fungsi sintetis sel juga dimodifikasi, ditandai dengan penurunan progresif sintesis jenis kolagen II, IX, dan XI dan peningkatan sintesis kolagen I, III dan Utyopov. Proteoglikan non-agregat kecil disintesis oleh aggrecan fungsional. Synthetzatepsin B dan L sangat rendah pada sel yang terdiferensiasi, namun dalam proses hilangnya diferensiasi meningkat. Kolagenase-1 diekspresikan dalam kondrositas yang berbeda, dengan kultivasi yang berkepanjangan, ekspresinya menurun, sementara produksi penghambat jaringan metaloprotease (TIMP) meningkat.

Kondrosit yang terdiferensiasi mengekspresikan kembali kolagen fenotipe yang terdiferensiasi saat dipindahkan dari kultur monolayer ke yang tertunda. Proses diferensiasi mungkin terkait dengan bentuk sel. Properti ini secara teratur digunakan oleh peneliti yang mempelajari transplantasi yang rusak dengan chondrosit autologous. Sejumlah kecil sel yang diperoleh dari bahan biopsi dapat dikalikan dalam kultur monolayer dan kemudian ditempatkan kembali dalam matriks tiga dimensi sebelum transplantasi. Re-ekspresi fenotipe spesifik oleh khondrosit dediferensial yang ditransfer ke kultur agarosa dapat distimulasi dengan TGF-p, kompleks ossein-hidroksiapatit dan asam askorbat.

Sebagai tanggapan terhadap pengaruh faktor pertumbuhan dan sitokin, khondrosit dimodifikasi selama proses diferensiasi. Respon seluler terhadap sitokin dan faktor pertumbuhan berbeda antara kondom yang tidak berdiferensiasi dan dibedakan. IL-1 merangsang proliferasi fibroblas, sementara pertumbuhan kelainan yang tidak berdiferensiasi dihambat oleh IL-1. Sintesis DNA dirangsang oleh IGF-1 dalam kondom yang memanjang namun tidak diratakan. Pada kondrosit yang terdiferensiasi, efek stimulasi IL-1β dan TNF-α pada produk prokolagenase lebih menonjol daripada yang tidak terdiferensiasi.

Budidaya chondrocytes

Budidaya chondrocytes dalam suspensi dalam media cair atau dalam matriks tiga dimensi alami atau sintetis menstabilkan fenotipe chondrocyte. Sel mempertahankan bentuk sferisnya, mensintesis protein spesifik jaringan. Kultur chondrocy tertimbang biasanya direkomendasikan untuk mempelajari pembentukan matriks periselular baru. Kultur chondrocyte pada polimer penyerap sintetis atau alami digunakan untuk menanamkan sel ke dalam defek tulang rawan untuk merangsang regenerasi jaringan tulang rawan sendi. Lingkungan sintetis atau alami untuk sel implan harus memenuhi beberapa persyaratan:

• Implan harus memiliki struktur berpori untuk adhesi dan pertumbuhan sel,
• baik polimer itu sendiri maupun produk degradasinya harus menyebabkan reaksi inflamasi atau toksik selama implantasi in vivo,
• pembawa transplantasi harus bisa mengikat tulang rawan atau tulang subkondral yang berdekatan,
• Matriks alami atau sintetis harus mampu menyerap, degradasinya harus diimbangi dengan regenerasi jaringan,
• Untuk memudahkan perbaikan kartilago, struktur kimia dan arsitektur matriks matriks harus membantu mempertahankan fenotip seluler yang dimasukkan ke dalam kondrosit dan sintesis protein spesifik jaringan,
• Selama implantasi in vivo, perlu untuk mempelajari sifat mekanik dari matriks sintetis atau alami.

[12], [13], [14], [15], [16]

Suspensi chondrocytes dalam fase cair

Melampirkan sel ke pembuluh darah di mana kondrosit diobati dapat dicegah dengan melapisi dindingnya dengan larutan metilselulosa, agarosa, hidrogel (poli-2-hidroksietil metakrilat) atau campuran kolagen-agarosa. Dengan kondisi ini, chondrocytes membentuk cluster dan mensintesis terutama aggrecan dan collagen jaringan tertentu (tipe II, IX, XI). Biasanya, dua jenis sel ditemukan. Sel-sel yang berada di tengah mempertahankan bentuk bola yang dikelilingi oleh ECM yang berkembang dengan baik, yang dikonfirmasi oleh studi histokimia dan ultrastruktural. Pada chondrocytes pinggiran memiliki kontur diskoid, dikelilingi oleh ECM langka; Sedikit yang diketahui tentang karakteristik fungsional sel tersebut.

Kultivasi kondrosit pada mikroarri yang didukung dalam suspensi dimungkinkan; Dextran beads (sitodex), manik-manik dekstran yang dilapisi kolagen (sitodex III), mikrosfer non-void kolagen tipe I (kolagen) digunakan sebagai microcarriers. Di bawah kondisi kultur ini, kondrosit menempel pada permukaan microcarrier, mempertahankan bentuk bola mereka, dan menghasilkan bahan seperti matriks. Selain itu, penggunaan kolagen mempromosikan proliferasi kondrosit dan reexpresi fenotipe normal. Oleh karena itu, budidaya chondrocytes pada mikrosfer kolagen dapat digunakan untuk mengembalikan fenotip sel sebelum transplantasi.

Metode lain untuk budidaya suspensi kondrosit dalam media cair adalah kultivasi mereka dalam bentuk manik padat yang terdiri dari sel (0,5-1 * 10 ^b ) yang diperoleh dengan sentrifugasi. Krososit semacam itu mampu menghasilkan matriks yang mengandung sejumlah besar proteoglikan, kolagen tipe II, tapi bukan kolagen tipe I, yang dikonfirmasi dengan metode histologis, imunohistokimia dan kuantitatif.

Penangguhan kondrosit dalam ECM alami

Chondrocytes dapat dikultur dalam suspensi dalam matriks tiga dimensi (agar lembut, agarose, gel kolagen atau spons, asam hyaluronic, lem fibrin, manik alginat).

Kandangositosaosaoseose yang dikawinkan mempertahankan fenotip normal mereka dan mensintesis kolagen tipe II dan agregat agregat agregat spesifik jaringan. Bila dikultur dalam agarosa, proteoglikan sel yang disintesis dilepaskan ke medium selama 50 hari. Sebagai perbandingan - dalam kultur monolayer fase sel dipenuhi dengan glikosaminoglikan yang sudah ada pada 5-6 hari pertama penanaman; ketika dibudidayakan dalam medium setelah sintesis dan pelepasan glikosaminoglikan diintensifkan, penurunan glikosaminoglikan yang bergantung waktu terjadi pada 8-10 hari pertama. Meskipun demikian, perilaku kondrosit selama kultivasi mereka pada agarosa berbeda dari kondisi in vivo. Dalam agarose, sejumlah besar agregat Aggregan yang disintesis mengandung molekul yang lebih kecil dan lebih kecil daripada in vivo. TGF-P merangsang sintesis proteoglikan dalam eksplan, namun mengurangi sintesis aggrecan pada agarose.

Alginat adalah polisakarida linier yang berasal dari rumput laut coklat. Dengan adanya kation divalen, seperti ^ion Ca ²⁺, polimer ini menjadi gel. Setiap chondrocyte yang ditemukan di alginate dikelilingi oleh matriks polisakarida bermuatan negatif yang pori-porinya sepadan dengan yang ada di tulang rawan hialin. Matriks yang membentuk chondrocyte dalam manik alginate terdiri dari dua bagian - lapisan tipis dari matriks terkait sel yang sesuai dengan matriks periselular dan teritorial, kartilago artikular dan matriks yang lebih jauh yang setara dengan matriks interterritorial pada jaringan asli. Pada hari ke 30 budidaya, volume relatif dan absolut yang ditempati oleh sel-sel, dan masing-masing dari dua divisi dalam manik alginat hampir sama dengan yang ada di tulang rawan asli. Selama hampir 30 hari, kondrosit mempertahankan bentuk bola mereka dan menghasilkan aggrecan yang sifat hidrodinamikanya serupa dengan molekul aggrecan dalam matriks tulang rawan artikular, serta molekul kolagen tipe II, IX dan XI. Pada saat yang sama, seperti kultur suspensi lainnya, sel-sel yang diratakan hadir pada permukaan alginate beads, yang menghasilkan sejumlah kecil molekul kolagen tipe I yang langsung dilepaskan ke medium dan tidak dimasukkan ke dalam ECM. Dalam manik-manik alginat, proliferasi kondrosit sedang diamati. Setelah 8 bulan berkultivasi di gel alginat, chondrocytes matang tidak kehilangan aktivitas metabolik dan terus mensintesis kolagen tipe-II kolagen dan aggrecan.

N. Tanaka dan rekan penulis (1984) menyelidiki sifat difusi berbagai molekul alami dalam alginat dan menemukan bahwa molekul yang lebih besar dari 70 kD tidak berdifusi melalui alginat. Dengan demikian, budidaya sel dalam alginat cocok untuk mempelajari regulasi biosintesis matriks dan pengorganisasian ECM. Ketersediaan sel yang dibudidayakan dalam alginat memungkinkan seseorang untuk menyelidiki pengaruh faktor regulasi peptida dan agen farmakologis pada tingkat transkripsi, posttranskripsi dan translasi.

Chondrocytes juga dikultur dalam matriks serat kolagen tipe I dan II. S. Nehrer dan rekan penulis (1997) membandingkan fungsi kondrosit anjing dalam matriks polimer kolagen-proteoglikan berpori yang mengandung kolagen dari berbagai jenis. Mereka menemukan perbedaan penting dalam morfologi fungsi biosintesis chondrocytes yang dikultur dalam matriks kolagen yang mengandung tipe kolagen I dan II. Sel dalam matriks kolagen tipe II melingkar bentuk bola mereka, sedangkan pada kolagen tipe I, mereka memiliki morfologi mirip fibroblas. Selain itu, dalam matriks kolagen tipe II, kondrosit menghasilkan lebih banyak glikosaminoglikan. J. Van Susante dkk (1995) membandingkan khasiat khondrosit yang dikultur dalam gel alginat dan kolagen (tipe I). Para penulis menemukan peningkatan yang signifikan dalam jumlah sel dalam gel kolagen, namun sejak hari ke 6 kultivasi sel-sel kehilangan fenotip karakteristik, berubah menjadi sel mirip fibroblas. Dalam gel alginat, penurunan jumlah sel diamati, namun kondrosit mempertahankan fenotip normal mereka. Dalam gel kolagen, jumlah proteoglikan per sel secara signifikan lebih tinggi daripada alginat, namun dalam gel, sintesis elemen matriks berkurang mulai dari hari ke 6 budidaya, sedangkan pada alginat, sintesis tersebut terus tumbuh.

Matriks fibrin tiga dimensi solid adalah zat alami yang mendukung kondrosit yang ditimbang di dalamnya dalam fenotip yang berbeda. Matriks fibrin 3D juga dapat digunakan sebagai pembawa untuk transplantasi chondrocyte. Kelebihan fibrin adalah tidak adanya sitotoksisitas, kemampuan mengisi ruang, kemampuan perekat. Dengan studi histologis dan biokimia, autoradiografi, mikroskop elektron, kondrosit dalam gel fibrin telah ditemukan untuk mempertahankan morfologi mereka, berkembang biak dan menghasilkan matriks bahkan setelah 2 minggu kultur. Namun, G. Homminga dan rekan penulis (1993) melaporkan bahwa, setelah 3 hari kultivasi, disintegrasi fibrin dimulai, dedifferentiasi chondrocytes berlangsung.

Suspensi kondrosit pada ECM buatan (sintetis)

Implan tulang rawan untuk operasi rekonstruktif atau ortopedi dapat diperoleh dengan menumbuhkan chondrocytes terisolasi secara in vitro dalam matriks biokompatibel sintetis.

Kondrosit asam poliglikol budidaya berkembang biak dan mempertahankan morfologi dan fenotip normal dalam 8 minggu. Kompleks asam chondrocyte-polyglycolic terdiri dari sel, glikosaminoglikan, kolagen, dan memiliki kapsul kolagen luar. Namun, dalam implan semacam itu ada dua jenis molekul kolagen - I dan II. Implan dari dedifferentiated oleh serangkaian bagian chondrocytes memiliki jumlah glikosaminoglikan dan kolagen yang lebih banyak daripada implan dari chondrocytes yang tidak berdiferensiasi.

L. Freed dan rekan penulis (1 993b) membandingkan perilaku budaya chondrocy manusia dan banteng dalam asam poliglikolat berserat (HPHC) dan asam polylactic (PPLC). Setelah 6-8 minggu budidaya chondrocytus banteng di HSVG atau PPLC, para penulis mengamati proliferasi sel dan regenerasi matriks kartilago. Di HSBC, chondrocytes berbentuk bulat, terletak di lacunae yang dikelilingi oleh matriks kartilago. Setelah 8 minggu kultur in vitro, jaringan regenerasi mengandung hingga 50% bahan kering (4% massa sel, 15% glikosaminoglikan, dan 31% kolagen). Pada sel PPLK berbentuk spindle, sejumlah kecil glikosaminoglikan dan kolagen. Di HSBC, pertumbuhan sel 2 kali lebih hebat daripada di PTCA. Dalam kondisi in vivo, chondrocytes yang ditanam di HPVC dan PPLC selama 1 sampai 6 bulan menghasilkan jaringan yang secara histologis mirip dengan tulang rawan. Implan mengandung glycosaminoglycans, tipe I dan tipe II collagen.

Kaldu banteng janin dikultur dalam polietilen hidrofobik dan hidrofilik berpori padat berpori. Setelah 7 hari inkubasi di kedua substrat, sel mempertahankan bentuk bola, terutama yang mengandung kolagen tipe II. Setelah 21 hari budidaya, ternyata matriks hidrofilik mengandung kolagen tipe II lebih banyak daripada matriks hidrofobik.

Jaringan tulang rawan juga dapat diperoleh dengan pembiakan dalam monolayer pada filter Millicell-CM. Pra-pelapis filter dengan kolagen diperlukan untuk pelekatan chondroits. Pemeriksaan histologis pada kultur menunjukkan akumulasi kondrosit dalam ECM yang mengandung proteoglikan dan kolagen tipe II. Kolagen tipe I dalam budaya seperti itu tidak terdeteksi. Chondrocytes dalam jaringan kartilaginous yang dihasilkan memiliki bentuk bola, namun pada permukaan jaringan mereka agak diratakan. Ketebalan jaringan yang baru terbentuk meningkat seiring waktu dan bergantung pada kerapatan awal monolayer sel. Dalam kondisi kultur optimal, ketebalan jaringan tulang rawan mencapai 110 pM, pengorganisasian sel dan kolagennya di permukaan dan lapisan dalam serupa dengan kartilago artikular. VKM mengandung sekitar 3 kali lebih banyak kolagen dan proteoglikan. Setelah 2 minggu berkultivasi, akumulasi matriks-sa dicatat, yang memungkinkan untuk mengekstrak jaringan dari filter dan menggunakannya untuk transplantasi.

Sims dkk (1996) mempelajari budidaya chondrocytes dalam matriks polimer encapsulated polietilena oksida-gel yang memungkinkan sejumlah besar sel diangkut dengan injeksi. Enam minggu setelah injeksi ke jaringan subkutan tikus athymic, tulang rawan baru dibentuk, yang secara morfologis ditandai dengan opalescence putih yang serupa dengan tulang rawan hialin. Data dari studi histologis dan biokimia menunjukkan adanya chondrocytes proliferasi aktif, yang menghasilkan ECM.

Eksplorasi

Pemeriksaan jaringan kartilaginous digunakan untuk mempelajari proses ana- katabolisme di dalamnya, homeostasis, resorpsi dan perbaikan. Chondrocytes dalam eksplan jaringan kartilaginous mendukung fenotip dan komposisi normal ECM, serupa dengan kartilago artikular in vivo. Setelah 5 hari berkultivasi dengan adanya serum, tingkat sintesis dan degradasi alami yang konstan tercapai. Penyebaran jaringan dapat dipercepat dalam kultur dan kultur utama dengan penambahan serum oleh sejumlah agen, misalnya lipopolisakarida bakteri IL-IB, TNF-a, bakteri, turunan asam retinoat atau radikal oksigen aktif. Untuk mempelajari perbaikan tulang rawan, kerusakannya diinduksi oleh mediator peradangan (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) atau ruptur fisik dari matriks.

Metode budaya organotipik adalah model untuk mempelajari efek in vitro dari faktor eksternal terisolasi pada kondrosit dan matriks sekitarnya. Secara in vivo, kondrosit jarang berada di ECM dan tidak saling bersentuhan. Kultur kartilago artikular eksplan mempertahankan struktur organisasi ini, serta interaksi antara kondrosit dan lingkungan ekstraselular sekitarnya. Model ini juga digunakan untuk mempelajari efek stres mekanis, agen farmakologi, faktor pertumbuhan, sitokin, hormon pada metabolisme tulang rawan.

Keuntungan lain dari eksplan jaringan cartilaginous adalah tidak adanya kerusakan kondrosit oleh enzim proteolitik atau faktor mekanis, yang tak terelakkan bila sel-sel diisolasi. Reseptor dan protein membran dan glikoprotein lainnya dilindungi dari faktor yang merusak.

[17], [18], [19], [20], [21]

Budaya chondrons

Chondron adalah unit struktural, fungsional dan metabolik tulang rawan artikular, yang terdiri dari chondrocyte, matriks pericellular dan kapsul filamen kompak, dan bertanggung jawab atas homeostasis matriks. Chondron diekstraksi secara mekanis dari tulang rawan dan dikumpulkan dengan beberapa homogenisasi kecepatan rendah berturut-turut. Terisolasi dari zona kedalaman kartilago yang berbeda, chondrons dapat dibagi menjadi empat kategori: chondron tunggal, chondron digabungkan, beberapa (tiga atau lebih) chondron linear (chondron columns), sekelompok chondrons.

Chondron tunggal biasanya ditemukan di lapisan tengah tulang rawan utuh, dipasangkan - di perbatasan lapisan tengah dan dalam, beberapa chondron linear memiliki ciri khas lapisan dalam tulang rawan utuh. Akhirnya, kelompok chondrons terdiri dari sekelompok chondron tunggal dan pasangan yang terorganisir secara acak yang mempertahankan keadaan gabungan setelah homogenisasi. Akumulasi chondron adalah fragmen tulang rawan besar, biasanya mengandung beberapa chondron dan fibril kolagen yang terletak secara radial, yaitu ciri khas organisasi lapisan dalam matriks. Chondron diimobilisasi dalam agarosa transparan, yang memungkinkan untuk mempelajari struktur, komposisi molekul dan aktivitas metaboliknya. Sistem chamber - chondron dianggap sebagai mikromodel tulang rawan, yang berbeda dari sistem agarose chondrocyte tradisional sehingga lingkungan mikro alami dipertahankan, tidak perlu melakukan sintesis dan perakitannya. Budaya chondrons adalah model untuk mempelajari interaksi sel dan matriks pada kartilago artikular dalam kondisi normal dan patologis.

[22], [23], [24], [25], [26], [27]

Budaya chondrocytes abadi

Untuk membuat garis sel permanen, DNA rekombinan atau onkogen yang mengandung virus digunakan yang bisa membuat sel "abadi". Immortal chondrocytes memiliki kemampuan untuk berkembang biak tanpa henti, mempertahankan fenotipe yang stabil. F. Mallein-Gerin dan rekan penulis (1995) menunjukkan bahwa SV40T-oncogene menginduksi proliferasi kondrosit tikus, yang terus mengekspresikan tipe kolagen II, IX dan XI, serta agregat artikular dan protein pengikat. Namun, sel semacam itu memperoleh kemampuan untuk mensintesis kolagen tipe I saat dikultur dalam kultur monolayer atau dalam gel agarosa.

W. Horton dan rekan penulis (1988) menggambarkan sederet sel abadi dengan ekspresi mRNA tipe kolagen tipe II yang rendah. Sel-sel ini diperoleh dengan mengubahnya dengan retrovirus tikus yang mengandung I-mikron dan y-ra-onkogen. Jenis sel ini adalah model unik untuk mempelajari interaksi matriks artikular dengan tidak adanya kolagen tipe II, serta regulasi sintesis kolagen tipe II.

Budaya chondropytes dengan gen yang bermutasi atau terhapus adalah model yang mudah digunakan untuk mempelajari fungsi fisiologisnya. Model ini sangat cocok untuk mempelajari peran molekul spesifik dalam pengorganisasian matriks kartilaginosa atau mempelajari efek berbagai faktor regulasi terhadap metabolisme tulang rawan. Chondrocytes dengan genom yang dihapus dari kolagen tipe IX mensintesis fibril kolagen yang lebih lebar dari biasanya, menunjukkan bahwa tipe kolagen IX mengatur diameter fibril. Seperti dicatat dalam Bab 1, mutasi gen COLEN yang mengkodekan kolagen tipe II pada keluarga dengan osteoarthritis umum primer baru saja terdeteksi. Untuk mempelajari efek kolagen mutan tipe II pada matriks artikular, R. Dharmrvaram dan rekan penulis (1997) melakukan transfeksi ("kontaminasi" dengan asam nukleat asing) dari COL ₂ AI yang rusak (arginine pada posisi 519 diganti dengan sistein) pada kondom janin manusia secara in vitro.

Sistem kokain. Pada sendi, tulang rawan berinteraksi dengan sel dari jenis lain yang terdapat pada membran sinovial, cairan sinovial, ligamen, tulang subchondral. Metabolisme khondrosit dapat dipengaruhi oleh berbagai faktor yang dapat larut yang disintesis oleh sel-sel ini. Jadi, tulang rawan artikular arthritis dihancurkan oleh enzim proteolitik dan radikal bebas, yang diproduksi oleh sel sinovial. Oleh karena itu, model telah dikembangkan untuk mempelajari interaksi kompleks antara tulang rawan dan jaringan sekitarnya, yang disebut dengan coculture.

S. Lacombe-Gleise dan rekan penulis (1995) membudidayakan kelinci dan osteoblas dalam sistem ko-kultur (COSTAR) di mana sel-sel dipisahkan oleh membran mikroporous (0,4 μm) yang memungkinkan pertukaran antara sel-sel dari dua jenis tanpa kontak langsung. Studi ini menunjukkan kemampuan osteoblas untuk merangsang pertumbuhan kondrosit melalui mediator yang mudah larut.

A.M. Malfait dan rekan penulis (1994) menyelidiki hubungan antara monosit darah perifer dan kondrosit. Model ini nyaman untuk mempelajari proses yang dimediasi oleh sitokin, pada arthropathies inflamasi (rheumatoid arthritis, spondilitis seronegatif, dll.). Penulis model memisahkan sel dengan membran pengikat protein dengan pori 0,4 μm dengan diameter. Studi tersebut menunjukkan bahwa monosit yang distimulasi dengan lipopolisakarida menghasilkan IL-1 dan TNF-a, yang menghambat sintesis aggrecan oleh chondrocytes dan berkontribusi pada degradasi agregat agregat yang telah disintesis.

K. Tada dan rekan penulis (1994) menciptakan model coculture dimana sel endotel dalam gel kolagen (tipe I) ditempatkan di ruang bagian dalam yang dipisahkan dari ruang luar dengan saringan 0,4 μm ukuran pori pada chondrocyte. Dalam keadaan isolasi lengkap dari ruang luar, sel endothelial manusia membentuk tabung dalam gel kolagen dengan adanya EGF atau TGF-a. Dengan budidaya simultan dari kedua jenis sel TGF, pembentukan sel yang tergantung oleh sel endotel dihambat. Penghambatan chondrocyte dari proses ini sebagian dieliminasi oleh antibodi anti-TGF-beta. Dapat diasumsikan bahwa TGF-beta yang diproduksi oleh kondrosit menekan vaskularisasi tulang rawan itu sendiri.

S. Groot dan rekan penulis (1994) secara bersamaan memelihara kondrosit dari zona hipertrofik dan proliferatif tulang tikus janin berusia 16 hari dengan potongan-potongan jaringan otak. Setelah 4 hari kultur, transdifferentiasi kondrosit menjadi osteoblas dan awitan pembentukan osteoid diamati. Setelah 11 hari berkultivasi, sebagian tulang rawan digantikan oleh jaringan tulang dan matriks tulang dikalsifikasi sebagian. Beberapa neuropeptida dan neurotransmitter diproduksi oleh jaringan otak, mempengaruhi metabolisme osteoblas atau memiliki reseptor pada mereka. Diantaranya, norepinephrine, peptida intestinal vasoaktif, peptida yang terkait dengan gen kalsitonin, zat P dan somatostatin dapat diisolasi . Dibudidayakan dengan chondrocytes, potongan-potongan jaringan otak dapat menghasilkan beberapa faktor ini, yang dapat menginduksi proses transdifferentiasi chondrocy menjadi osteoblas.

[28], [29], [30], [31], [32], [33]

Pengaruh faktor eksternal pada kultur kondrosit

Efek ketegangan oksigen pada metabolisme chondrosit

Dalam kebanyakan kasus, kultur chondrocyte berkembang dalam kondisi ketegangan oksigen di atmosfer. Meskipun demikian, diketahui bahwa inondivo chondrocytes ada di bawah kondisi hipoksia dan ketegangan oksigen bervariasi dengan kondisi patologis yang berbeda. Selama proses pematangan, perubahan signifikan dalam suplai darah epiphyses diamati. Karena vaskularisasi bervariasi di berbagai bidang pelat pertumbuhan, ketegangan oksigen di dalamnya juga bervariasi. C. Brighton dan R. Heppenstall (1971) menunjukkan bahwa di lempeng tibia pada kelinci, ketegangan oksigen di zona hipertrofik kurang dari pada tulang rawan di sekitarnya. Pengukuran beberapa parameter metabolik telah menunjukkan bahwa kondrosit mampu bereaksi cepat terhadap perubahan konsentrasi oksigen lokal. Pertama-tama, dengan tegangan oksigen rendah, konsumsi kondrositnya menurun. Dengan penurunan tekanan oksigen dari 21 menjadi 0,04%, utilisasi glukosa meningkat, aktivitas enzim glikolisis dan sintesis asam laktat meningkat. Bahkan dengan tegangan oksigen rendah, jumlah ATP, ADP, dan AMP tetap stabil. Data ini menunjukkan arah metabolisme chondrocyte untuk memaksimalkan konservasi energi. Meskipun demikian, aktivitas sintetis, dan karenanya proses reparasi, berubah dalam kondisi hipoksia.

Ketegangan oksigen yang tinggi juga mempengaruhi metabolisme chondrocytes, yang menyebabkan penurunan sintesis proteoglikan dan DNA, degradasi matriks tulang rawan. Efek ini, sebagai aturan, disertai oleh produksi radikal oksigen bebas.

Pengaruh konsentrasi ion dan tekanan osmotik pada lingkungan pada fungsi kondrosit

Pada kartilago asli, konsentrasi ion berbeda secara signifikan dari pada jaringan lain: kandungan natrium dalam media ekstraselular adalah 250-350 mmol, dan osmolaritasnya adalah 350-450 mosmol. Saat mengisolasi kondrosit dari ECM dan menginkubasi mereka di media standar (DMEM (Minimum Essential Medium Dulbecco), osmolaritasnya adalah 250-280,7 mosmol), lingkungan sekitar sel berubah secara dramatis. Selain itu, konsentrasi kalsium dan potasium di media standar jauh lebih rendah daripada pada jaringan asli, dan konsentrasi anion jauh lebih tinggi.

Penambahan sukrosa ke medium menyebabkan peningkatan osmolaritasnya dan menginduksi peningkatan intraselular transien dalam konsentrasi ion H ⁺ dan kalsium dalam sitosol. Perubahan intraselular semacam itu dapat mempengaruhi proses diferensiasi chondrocyte dan aktivitas metaboliknya. J. Urban et al. (1993) menemukan bahwa penggabungan ³⁵ 8-sulfat dan ³ H-prolin dengan chondrocytes terisolasi yang diinkubasi dalam media DMEM standar selama 2-4 jam hanya 10% dari yang ada pada jaringan asli. Intensitas sintesis mencapai maksimum dengan osmolaritas medium ekstraselular 350-400 mosmol baik pada kondilit yang baru diisolasi dan pada eksplan jaringan kartilaginosa. Selain itu, volume chondrocyte meningkat 30-40% setelah menempatkan sel terisolasi dalam media DMEM standar dari osmolaritas tersebut. Namun, dalam budidaya chondrocytes di bawah osmolaritas nonfisiologis selama 12-16 jam, sel-sel beradaptasi dengan kondisi baru, mengurangi intensitas biosintesis sebanding dengan osmolaritas media ekstraselular.

P. Borgetti dan rekan penulis (1995) meneliti pengaruh osmolaritas media ekstraselular terhadap pertumbuhan, morfologi dan biosintesis chondrosit babi. Para penulis menunjukkan ciri biokimia dan morfologi kondrosit yang sama yang dikultur di media dengan osmolaritas 0,28 dan 0,38 mosmol. Dengan osmolaritas 0,48 mosmol selama 4-6 jam pertama kultur, proliferasi sel dan sintesis protein berkurang, namun kemudian parameter ini pulih, yang akhirnya mencapai nilai kontrol. Ketika chondrocytes dikultur dalam medium dengan osmolaritas 0,58 sel mosmol kehilangan kemampuan untuk mempertahankan intensitas fisiologis proses proliferatif dan setelah 6 hari jumlah kondrosit menurun secara signifikan. Dengan osmolaritas medium, 0,58 mosmol, penghambatan sintesis protein yang dalam diamati. Selain itu, ketika kultur di media dengan osmolaritas 0,28-0,38 mosmol, kondrosit mempertahankan fenotipe fisiologis, dengan osmolalitas tinggi (0,48-0,58 mosmol), perubahan signifikan pada morfologi sel terjadi, yang dimanifestasikan oleh hilangnya fenotipe karakteristik, transformasi kondrosit menjadi sel fibroblas-seperti, serta kehilangan sel, kemampuan untuk merakit proteoglikan matriks. Hasil penelitian ini menunjukkan kemampuan kondrosit untuk merespon osilasi osmolalitas terbatas di lingkungan ekstraselular.

Perubahan konsentrasi ion lain juga dapat mempengaruhi proses biosintesis pada kondrosit. Dengan demikian, tingkat inklusi ³⁵ S (sulfat) meningkat setengahnya dengan peningkatan konsentrasi ion kalium dari 5 mmol (konsentrasi pada media DM DM standar) sampai 10 mmol (konsentrasi VKM in vivo). Konsentrasi kalsium di bawah 0,5 mmol berkontribusi terhadap produksi kolagen oleh kondrosit banteng matang, sementara konsentrasi 1-2 mmol (sesuai dengan konsentrasi pada media DM DM standar) menyebabkan penurunan sintesis kolagen yang signifikan. Peningkatan biosintesis moderat diamati pada kadar kalsium tinggi (2-10 mmol). Berbagai kation berperan dalam pelekatan chondrocytes ke protein VKM. Dengan demikian, ion magnesium dan mangan memberikan pelekatan pada fibronektin dan kolagen tipe II, sedangkan ion kalsium tidak berpartisipasi dalam pelekatan kondrosit ke protein. Dengan demikian, hasil penelitian yang dijelaskan menunjukkan pengaruh perubahan ion ekstraselular kalium, natrium, kalsium dan osmolaritas medium terhadap fungsi biosintesis chondrocytes yang diinkubasi pada media standar.

Pengaruh tekanan mekanis pada metabolisme kondrosit

Imobilisasi sendi menyebabkan atrofi reversibel pada tulang rawan, yang mengindikasikan perlunya rangsangan mekanis untuk proses metabolisme normal di ECM. Dalam kebanyakan kasus, model kultur sel yang digunakan ada di bawah kondisi tekanan atmosfir normal. M. Wright dan rekan penulis (1996) menunjukkan bahwa lingkungan mekanik mempengaruhi metabolisme kondrosit, respon sel bergantung pada intensitas dan frekuensi beban kompresi. Percobaan dengan pemuatan pada eksplan tulang rawan artikular utuh secara in vitro menunjukkan penurunan sintesis protein dan proteoglikan di bawah aksi beban statis, sementara pemuatan dinamis merangsang proses ini. Mekanisme yang tepat untuk menyadari pengaruh beban mekanis pada tulang rawan adalah kompleks dan mungkin terkait dengan deformasi sel, tekanan hidrostatik, tekanan osmotik, potensi listrik dan reseptor seluler permukaan terhadap molekul matriks. Untuk mempelajari pengaruh masing-masing parameter ini, perlu dibuat sistem dimana satu parameter dapat bervariasi secara terpisah. Misalnya, budaya eksplan tidak cocok untuk mempelajari deformasi sel, namun dapat digunakan untuk mempelajari keseluruhan efek tekanan pada aktivitas metabolik chondrocytes. Kompresi tulang rawan menyebabkan deformasi sel, dan juga disertai dengan munculnya gradien tekanan hidrostatik, potensi listrik, aliran fluida dan perubahan parameter fisikokimia seperti kadar air dalam matriks, densitas muatan listrik, dan tingkat tekanan osmotik. Deformasi sel dapat dipelajari dengan menggunakan chondrocytes terisolasi yang direndam dalam gel agarose atau kolagen.

Beberapa sistem telah dikembangkan untuk mempelajari efek stimulasi mekanis terhadap kultur kondrosit. Beberapa peneliti menggunakan sistem untuk tujuan ini dimana tekanan diterapkan pada kultur sel melalui fase gas. Dengan demikian, JP Veldhuijzen dkk (1979), dengan menggunakan tekanan di atas atmosfir pada suhu 13 kPa pada frekuensi rendah (0,3 Hz) selama 15 menit, mengamati peningkatan sintesis cAMP dan proteoglikan dan penurunan sintesis DNA. R. Smith dan rekan penulis (1996) menunjukkan bahwa paparan kultur interferon chondrocyte yang pertama terhadap tekanan hidrostatik (10 MPa) pada frekuensi 1 Hz selama 4 jam menyebabkan peningkatan sintesis kolagen aggrek dan tipe II, sementara tekanan konstan tidak mempengaruhi proses ini. Dengan menggunakan sistem yang sama, M. Wright dan rekan penulis (1996) melaporkan bahwa tekanan siklik pada kultur sel dikaitkan dengan hiperpolasiasi membran sel kondrosit dan aktivasi saluran potasium Ca ²⁺. Dengan demikian, efek tekanan siklik dimediasi oleh saluran ion, diaktifkan dengan peregangan, pada membran chondrocyte. Respon kondroskop terhadap tekanan hidrostatik tergantung pada kondisi kultur sel dan frekuensi beban yang diterapkan. Dengan demikian, tekanan hidrostatik siklik (5 MPa) mengurangi inklusi sulfat dalam monolayer kondrosit pada frekuensi 0,05, 0,25 dan 0,5 Hz, sedangkan pada frekuensi lebih dari 0,5 Hz, dimasukkannya sulfat dalam kartilago eksplan meningkat.

M. Bushmann dkk (1992) melaporkan bahwa kondrosit dalam gel agarose mengubah biosintesis sebagai respons terhadap beban mekanik statis dan dinamis dengan cara yang sama seperti organ utuh yang berbudaya. Para penulis menemukan bahwa beban mekanis menghasilkan stimulus hyperosmotic diikuti oleh penurunan pH pada kondrosit.

Efek peregangan mekanis dapat dipelajari pada kultur sel yang direndam dalam gel. Kekuatan peregangan dapat dibuat dengan menggunakan vakum yang dikendalikan komputer. Ketika sistem dalam ruang hampa pada tingkat tertentu, bagian bawah cawan Petri dengan kultur sel diperpanjang dengan jumlah tertentu, deformasi maksimal di tepi bagian bawah cangkir dan minimal di tengahnya. Peregangan ditularkan dan dikultur dalam cawan petri dari chondrocytes. Dengan metode ini, Holm-Vall K. Et al (1995) menunjukkan bahwa berbudaya di kolagen (tipe II) sel gel chondrosarcoma meningkatkan ekspresi mRNA dan ₂ -integrina. Dan ₂ p _g integrin mampu mengikat kolagen tipe II. Ini dianggap sebagai mechanoreceptor, karena berinteraksi dengan protein pengikat aktin, sehingga menghubungkan ECM dan sitoskeleton.

Pengaruh pH pada Metabolisme Chondrocyte

PH cairan interstisial ECM pada jaringan tulang rawan lebih asam daripada di jaringan lain. A. Maroudas (1980) menentukan pH tulang rawan artikular pada 6,9. W. Diamant dan rekan penulis (1966) menemukan pH 5,5 dalam kondisi patologis. Diketahui bahwa chondrocytes hidup pada PO2 rendah, yang mengindikasikan peran penting glikolisis (95% dari total metabolisme glukosa) dalam metabolisme sel-sel ini; glikolisis disertai dengan produksi sejumlah besar asam laktat.

Selain pengasaman lingkungan oleh produk glikolisis, komponen matriks itu sendiri sangat penting. Sejumlah besar muatan negatif tetap pada proteoglikan memodifikasi komposisi ionik ekstraselular: kation bebas konsentrasi tinggi (misalnya, H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) dan konsentrasi anion rendah (misalnya O2, HCO3) dicatat. Selain itu, di bawah pengaruh beban mekanis, air dikeluarkan dari ECM, yang menyebabkan peningkatan konsentrasi muatan negatif tetap dan daya tarik kation lebih banyak pada matriks. Hal ini disertai dengan penurunan pH media ekstraselular, yang mempengaruhi pH intraselular, sehingga memodifikasi metabolisme chondrosit. R. Wilkin dan A. Hall (1995) mempelajari pengaruh pH medium ekstraselular dan intraselular pada biosintesis matriks dengan kondilus banteng yang diisolasi. Mereka mengamati modifikasi ganda sintesis matriks dengan penurunan pH. Sebuah penurunan dalam pH (7,4 35 S0 ₄ dan ³ H-prolin dalam kondrosit, sedangkan pengasaman lebih dalam (pH <7,1) menghambat sintesis dengan 75% dibandingkan dengan kontrol. Menciptakan pH rendah yang sama (6,65) dengan ion amonium menyebabkan penurunan sintesis matriks hanya 20%. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa modifikasi pH medium sintesis matriks ekstraselular tidak dapat dijelaskan hanya dengan perubahan pH medium intraselular. Selanjutnya, kondrosit memiliki kemampuan untuk mengatur pH intraseluler oleh Na ⁺, H ⁺ penukar, Ca ⁺ -tergantung C1 ^_ -NSOZ -CONVEYORS dan H ⁺ / ATPase.

[34], [35], [36], [37], [38], [39], [40]

Pengaruh komposisi medium untuk budidaya pada metabolisme chondrocytes

Media untuk mengkultivasi chondrocytes harus sesuai dengan kondisi percobaan. Dalam beberapa tahun terakhir, serum betis telah digunakan untuk mengoptimalkan kondisi kultur. Namun, bila menggunakan serum, sejumlah poin penting harus dipertimbangkan:

• Pertumbuhan sel eksternal dari pinggiran jaringan pada kultur organ,
• variabilitas komposisi sera dari berbagai seri,
• adanya komponen yang tidak diketahui di dalamnya,
• Peningkatan risiko gangguan, artifak dalam penelitian pengaruh berbagai faktor biologis terhadap aktivitas metabolisme sel.

Contoh yang terakhir adalah studi tentang efek EGF pada kondilop tulang rawan pada tikus. EGF merangsang penggabungan ³ H-timidin dan peningkatan kandungan DNA dalam kultur. Efek ini lebih terasa pada konsentrasi serum rendah (<1%), namun pada konsentrasi tinggi (> 7,5%), efeknya hilang.

Telah diketahui dengan pasti bahwa kadar sintesis dan degradasi DMEM yang diperkaya dengan serum betis meningkat secara signifikan dibandingkan dengan kondisi in vivo. Perbedaan antara in vivo dan metabolisme in vitro dapat disebabkan oleh perbedaan antara cairan sinovial dan lingkungan di mana sel-selnya berbudaya. D. Lee dkk (1997) mengolah chondrocytes sapi muda di agarose menggunakan media nutrisi yang mengandung DMEM yang diperkaya dengan serum betis 20% dan sejumlah besar cairan sinovial alogenik normal. Adanya cairan sinovial dalam media menyebabkan peningkatan jumlah proteoglikan, sampai 80% dari jumlah total cairan sinovial. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa cairan sinovial dalam kultur menginduksi tingkat metabolisme yang serupa dengan in vivo, dengan tingkat sintesis glikosaminoglikan yang tinggi dan tingkat pembelahan sel yang rendah.

G. Verbruggen dan rekan penulis (1995) menunjukkan bahwa sintesis ³⁵ S-arrpeKaHa oleh manusia chondrocytes yang dikultur dalam agarose dalam DMEM tanpa serum adalah 20-30% dari tingkat sintesis yang diamati pada DMEM yang diperkaya dengan serum betis 10%. Para penulis menentukan sejauh mana IGF-1, IGF-2, TGF-P atau insulin mengembalikan produksi aggrecan di media bebas serum. Penulis menyimpulkan bahwa 100 ng / ml insulin, IGF-1 atau IGF-2 mengurangi sintesis aggrecan menjadi 39-53% dari tingkat kontrol. Dengan kombinasi faktor-faktor ini, tidak ada fenomena sinergis atau kumulatif yang telah diidentifikasi. Pada saat bersamaan, 10 ng / ml TGF-P dengan adanya 100 ng / ml insulin merangsang sintesis aggrecan hingga 90% atau lebih dari tingkat referensi. Akhirnya, transferin serum, sendiri atau kombinasi dengan insulin, tidak mempengaruhi sintesis aggrecan. Ketika serum betis diganti dengan albumin serum sapi, kandungan agregat agregat secara signifikan berkurang. Pengayaan media untuk kultur insulin, IGF atau TGF-P sebagian memulihkan kemampuan sel untuk menghasilkan agregat agregat. Dalam kasus ini, IGF-1 dan insulin mampu mempertahankan homeostasis dalam kultur sel. Setelah 40 hari budidaya dalam medium diperkaya dengan IGF-1 10-20 ng / ml, sintesis proteoglikan dipertahankan pada tingkat yang sama atau bahkan lebih tinggi dari pada medium yang mengandung serum betis 20%. Proses katabolik berlangsung lebih lambat dalam medium yang diperkaya dengan IGF-1 daripada di media yang diperkaya dengan larutan albumin 0,1%, namun agak lebih cepat dalam media diperkaya dengan serum 20%. Dalam budaya lama, 20 ng / ml IGF-1 mempertahankan keadaan sel yang stabil.

D. Lee dan rekan penulis (1993) membandingkan pengaruh komposisi medium kultur (DMEM, DMEM + 20% serum betis, DMEM + 20 ng / ml IGF-1) terhadap sintesis DNA dalam kultur eksplan rektum, kultur monolayer dan suspensi agarose. . Bila dikultur dalam agarose dengan adanya serum, penulis mengamati kecenderungan mengelompokkan khondrosit ke dalam kelompok besar. Sel yang dibiakkan tanpa serum atau dengan IGF-1 disimpan dalam agarosa berbentuk bulat, disusun menjadi beberapa kelompok kecil, namun tidak membentuk agregat besar. Dalam monolayer, sintesis DNA secara signifikan lebih tinggi pada media yang mengandung serum daripada di media yang diperkaya dengan IGF-1; Sintesis DNA pada yang terakhir jauh lebih tinggi daripada di lingkungan yang tidak diperkaya. Dalam budidaya chondrocytes dalam suspensi dalam agarose dalam media yang tidak diperkaya dan di media dengan IGF-1, tidak ada perbedaan dalam sintesis DNA yang diamati. Pada saat yang sama, mengkultur suspensi chondrocyte dalam agarose dalam media yang diperkaya dengan serum disertai dengan penambahan penggabungan timin ³ H-timidin radionuklida dibandingkan dengan media lainnya.

Vitamin C diperlukan untuk mengaktifkan enzim yang terlibat dalam pembentukan struktur spiral fibril kolagen yang stabil. Chondrocytes, kekurangan sehubungan dengan asam askorbat, mensintesis prekursor non-heliks non-heliks di bawah hidroksilasi, yang secara perlahan disekresikan. Pengenalan asam askorbat (50 μg / ml) menyebabkan hidroksilasi kolagen tipe II dan IX dan sekresi dalam jumlah normal. Penambahan vitamin C tidak mempengaruhi tingkat sintesis proteoglikan. Akibatnya, sekresi kolagen diatur secara independen dari sekresi proteoglikan.

[41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]