Model eksperimental osteoartritis

Tulang rawan adalah jaringan yang sangat terspesialisasi yang hanya mengandung satu jenis sel (kondrosit) dan ditandai dengan tidak adanya pembuluh darah dan limfatik. Tulang rawan terutama diberi nutrisi melalui penyerapan dari cairan sinovial. Metabolisme kondrosit diatur oleh sejumlah faktor terlarut yang diproduksi secara lokal oleh kondrosit dan jaringan di sekitarnya. Fungsi kondrosit juga bergantung pada komposisi lingkungan ekstraseluler (ketegangan oksigen, konsentrasi ion, pH, dll.), komposisi ECM, interaksi sel dan matriks, dan sinyal fisik. Tujuan utama pemodelan eksperimental adalah untuk membuat kultur di lingkungan ekstraseluler tanpa mengubah fenotipe sel dewasa. Tujuan kedua adalah untuk membuat kultur guna mempelajari respons kondrosit yang prematur, tertunda, jangka pendek, atau berkepanjangan terhadap sinyal kimia dan/atau fisik. Studi in vitro juga memberikan kesempatan untuk mempelajari perilaku kondrosit dalam osteoartrosis. Tujuan ketiga adalah untuk mengembangkan sistem kokultur yang memungkinkan mempelajari interaksi berbagai jaringan dalam sendi. Tugas keempat adalah persiapan implan tulang rawan untuk transplantasi selanjutnya. Dan akhirnya, tugas kelima adalah mempelajari faktor pertumbuhan, sitokin atau agen terapeutik yang mampu merangsang perbaikan dan/atau menghambat resorpsi tulang rawan.

Selama beberapa dekade terakhir, berbagai model kultur sel tulang rawan artikular telah dibuat, termasuk kultur monolayer, kultur tersuspensi, kultur kondron, eksplan, kokultur, dan kultur sel immortal. Setiap kultur memiliki kelebihan dan kekurangannya sendiri, dan masing-masing cocok untuk mempelajari satu aspek spesifik metabolisme kondrosit. Dengan demikian, eksplan tulang rawan merupakan model yang sangat baik untuk mempelajari pergantian elemen matriks, yang memerlukan reseptor permukaan sel asli dan interaksi sel-matriks dan matriks-sel yang normal. Pada saat yang sama, direkomendasikan untuk mempelajari endapan matriks atau mekanisme yang mengatur metabolisme kondrosit pada kultur sel yang diisolasi. Kultur monolayer dengan kepadatan rendah diperlukan untuk mempelajari proses diferensiasi sel. Kultur yang tersuspensi dalam matriks alami atau sintetis merupakan model untuk menganalisis respons adaptif kondrosit terhadap stres mekanis.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Kultur kondrosit

Beberapa poin penting harus diperhitungkan ketika memilih jaringan tulang rawan untuk studi in vitro. Komposisi matriks dan aktivitas metabolik kondrosit bervariasi di antara sendi, dan yang terakhir juga bergantung pada kedalaman lokasi kondrosit di jaringan. Data ini diperoleh dalam beberapa percobaan di mana subpopulasi kondrosit terisolasi dari zona tulang rawan dengan kedalaman berbeda dipelajari. Sejumlah perbedaan morfologi dan biokimia ditemukan antara kondrosit kultur yang terletak di lapisan superfisial dan dalam tulang rawan artikular. Sel-sel superfisial mensintesis matriks fibrilar yang jarang dan miskin proteoglikan, sedangkan sel-sel yang lebih dalam menghasilkan matriks yang kaya akan fibril dan proteoglikan. Selain itu, sel-sel superfisial menghasilkan proteoglikan non-agregat yang relatif lebih kecil dan asam hialuronat dan relatif lebih sedikit agrekan dan keratan sulfat daripada kondrosit yang lebih dalam. Ciri khas penting lainnya dari metabolisme kondrosit yang diisolasi dari zona tulang rawan dengan kedalaman yang berbeda adalah respons terhadap stimulus eksogen. Menurut M. Aydelotte dkk., kondrosit sapi dari zona superfisial tulang rawan lebih sensitif terhadap IL-1 dibandingkan sel dari zona dalam.

Perilaku sel juga bergantung pada lokasi jaringan. Kondrosit dari tulang rawan tulang rusuk dan telinga dari hewan yang sama merespons faktor pertumbuhan seperti faktor pertumbuhan fibroblast (FGF) dan TGF-beta secara berbeda. FGF meningkatkan penggabungan timidin, prolin, dan leusin ke dalam tulang rusuk yang dikultur tetapi tidak pada kondrosit telinga. TGF-beta meningkatkan penggabungan timidin ke dalam kondrosit tulang rawan tulang rusuk dan telinga tetapi tidak berpengaruh pada penggabungan timidin dan prolin ke dalam kondrosit telinga. Sel-sel tulang rawan dari area dengan tekanan tinggi berbeda dari sel-sel dari area dengan tekanan rendah pada tulang rawan. Dengan demikian, kondrosit tulang rawan sendi lutut domba dewasa dari daerah tengah permukaan artikular tibia yang tidak ditutupi oleh meniskus, yang menanggung beban terbesar secara in vivo, mensintesis lebih sedikit agrekan, tetapi lebih banyak dekorin daripada sel-sel dari zona yang ditutupi oleh meniskus. Para penulis juga menekankan pentingnya menggunakan tulang rawan dari zona sendi yang identik saat mempelajari fungsi sintetis sendi.

Metabolisme kondrosit dan responsnya terhadap faktor pengatur juga sangat bergantung pada usia donor, perkembangan kerangkanya, dan kondisi sendi tempat sel diambil. Pada kondrosit manusia, penurunan respons proliferatif yang signifikan diamati seiring bertambahnya usia. Penurunan terbesar diamati pada donor berusia 40-50 tahun dan lebih dari 60 tahun. Selain itu, tingkat keparahan respons proliferatif terhadap faktor pertumbuhan (misalnya, FGF dan TGF-beta) menurun seiring bertambahnya usia. Selain perubahan kuantitatif dalam proliferasi kondrosit, ada juga perubahan kualitatif. Sel dari donor muda (10-20 tahun) merespons lebih baik terhadap faktor pertumbuhan yang berasal dari trombosit (PDGF) daripada terhadap TGF-beta, sementara yang sebaliknya diamati pada sel dari donor dewasa. Beberapa mekanisme digunakan untuk menjelaskan perubahan yang bergantung pada usia dalam fungsi sintetis kondrosit dan responsnya terhadap faktor pertumbuhan. Ini termasuk penurunan jumlah dan afinitas reseptor sel permukaan, perubahan sintesis dan bioaktivitas faktor pertumbuhan dan sitokin, dan modifikasi sinyal pasca-reseptor.

Kondisi patologis sendi juga mengubah morfologi dan aktivitas metabolisme kondrosit. Dengan demikian, J. Kouri et al. (1996) mengidentifikasi tiga subpopulasi kondrosit dalam tulang rawan pada osteoartrosis. Kondrosit dari bagian superfisial dan atas tengah tulang rawan membentuk kelompok dan mensintesis sejumlah besar proteoglikan dan kolagen. TGF-beta dan faktor pertumbuhan mirip insulin (IGF) mampu merangsang sintesis proteoglikan oleh kondrosit dan menetralkan sebagian efek IL-1 dan TNF-a. Eksplan tulang rawan yang terkena osteoartrosis dan kondrosit yang diisolasi dari tulang rawan pasien dengan osteoartrosis lebih sensitif terhadap stimulasi TGF-beta daripada kondrosit tulang rawan yang sehat. Perbedaan ini kemungkinan besar terkait dengan perubahan fenotipik pada kondrosit di lapisan atas tulang rawan artikular.

Isolasi kondrosit individu dicapai dengan perlakuan berurutan ECM dengan enzim proteolitik. Setelah dilepaskan dari ECM, sel-sel yang diisolasi ideal untuk mempelajari sintesis de novo komponen matriks. Beberapa penulis hanya menggunakan kolagenase klostridial, sementara yang lain melakukan pra-inkubasi tulang rawan dengan tripsin, pronase, DNase, dan/atau hialuronidase. Jumlah sel yang diisolasi bergantung pada enzim yang digunakan. Jadi, ketika diperlakukan dengan kolagenase saja, 1,4-10 ⁶ kondrosit dapat diperoleh dari 1 g jaringan, sementara menggunakan pronase, hialuronidase, dan kolagenase - 4,3-10 ⁶. Ketika diperlakukan dengan kolagenase, aggrekan, protein, IL-6, dan IL-8 tetap berada dalam kultur sel dalam jumlah yang jauh lebih besar daripada dengan perlakuan berurutan dengan enzim yang berbeda. Ada beberapa penjelasan untuk perbedaan antara kedua kultur sel ini:

• Reseptor sel rusak atau terhambat oleh enzim, TGF-beta menghambat sintesis DNA dan proteoglikan pada kondrosit yang baru diisolasi (hari ke-1), sedangkan sintesis DNA dan proteoglikan pada kondrosit yang dikultur dalam satu lapisan (7 hari) dirangsang oleh TGF-beta. Namun, diperlukan waktu yang cukup untuk ekspresi ulang komponen membran ini sebelum dimulainya percobaan.
• Protease eksogen dapat mengganggu interaksi sel-matriks yang dimediasi integrin. Famili integrin mendorong perlekatan kondrosit ke molekul ECM (Shakibaei M. et al., 1997). Gangguan ini dapat memengaruhi ekspresi gen matriks.
• Sisa komponen matriks dapat mengatur fungsi sintetis kondrosit. Integrin mampu mengenali produk degradasi ECM, sehingga memainkan peran penting dalam perbaikan jaringan setelah aksi enzim proteolitik. T. Larsson et al. (1989) melaporkan bahwa penambahan proteoglikan utuh atau terfragmentasi ke kultur sel merangsang sintesis protein dan proteoglikan. Namun, kadar asam hialuronat yang tinggi menyebabkan penurunan yang signifikan dalam penyertaan sulfat dalam sintesis proteoglikan oleh kondrosit embrio ayam, kondrosit dewasa sel kondrosarkoma babi dan tikus. Selain itu, asam hialuronat merupakan penghambat pelepasan proteoglikan dari sel bahkan dengan adanya IL-1b, TNF-a, FGF, yang menunjukkan penangkalan aktivitas biologis pertama dari faktor pertumbuhan dan sitokin. Mekanisme pasti yang mendasari aksi asam hialuronat masih belum jelas; Kondrosit diketahui mengandung reseptor untuk asam hialuronat yang terkait dengan filamen aktin sitosol. Pengikatan asam hialuronat ke reseptornya merangsang fosforilasi protein. Dengan demikian, data ini menunjukkan modulasi fungsi metabolisme kondrosit oleh molekul protein matriks yang terfragmentasi atau asli melalui aktivasi reseptor membran sel.
• Stimulasi cepat sintesis protein matriks oleh kondrosit oleh enzim mungkin merupakan konsekuensi dari perubahan bentuk kondrosit dan/atau reorganisasi sitoskeletal.
• Beberapa sitokin (misalnya, IL-8) dan faktor pertumbuhan (misalnya, IGF-1, TGF-β) diasingkan dalam ECM. Contoh yang paling terkenal adalah pengikatan TGF-β oleh dekorin, yang mengakibatkan penurunan kemampuan TGF-β untuk menginduksi pertumbuhan sel dalam sel ovarium hamster Cina. Temuan bahwa kandungan dekorin dalam tulang rawan meningkat seiring bertambahnya usia menunjukkan penurunan bioavailabilitas TGF-β seiring bertambahnya usia. Faktor pertumbuhan dan sitokin dapat dilepaskan dari serpihan matriks selama kultur dan selanjutnya memodulasi fungsi kondrosit.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Kultur kondrosit monolapis

Fenotipe kondrosit yang berdiferensiasi terutama ditandai oleh sintesis kolagen tipe II dan proteoglikan spesifik jaringan, serta tingkat aktivitas mitosis yang rendah. Ada bukti bahwa dengan kultivasi sel yang berkepanjangan dalam satu lapisan, serta setelah beberapa kali pergantian sel yang berulang, kondrosit kehilangan garis luarnya yang bulat dan memperoleh bentuk yang memanjang seperti fibroblas. Dengan metaplasia fibroblastik seperti itu, fungsi sintesis sel juga dimodifikasi, ditandai dengan penurunan progresif dalam sintesis kolagen tipe II, IX dan XI dan peningkatan sintesis kolagen tipe I, III dan Y. Proteoglikan kecil yang tidak teragregasi disintesis karena agrekan fungsional. Sintesis katepsin B dan L sangat rendah pada sel yang berdiferensiasi, tetapi meningkat dalam proses hilangnya diferensiasi. Kolagenase-1 diekspresikan dalam kondrosit yang berdiferensiasi; dengan kultivasi yang berkepanjangan, ekspresinya menurun, sementara produksi penghambat jaringan metaloprotease (TIMP) meningkat.

Kondrosit yang berdiferensiasi mengekspresikan kembali kolagen dari fenotipe yang berdiferensiasi saat dipindahkan dari lapisan tunggal ke kultur tersuspensi. Proses diferensiasi kemungkinan terkait dengan bentuk sel. Properti ini secara teratur digunakan oleh para peneliti yang mempelajari cangkokan yang rusak dengan kondrosit autolog. Sejumlah kecil sel yang diperoleh dari bahan biopsi dapat diperbanyak dalam kultur lapisan tunggal dan kemudian dimasukkan kembali ke dalam matriks tiga dimensi sebelum transplantasi. Ekspresi ulang fenotipe tertentu oleh kondrosit yang terdiferensiasi yang dipindahkan ke kultur agarosa dapat distimulasi oleh TGF-β, kompleks ossein-hidroksiapatit, dan asam askorbat.

Sebagai respons terhadap faktor pertumbuhan dan sitokin, kondrosit dimodifikasi selama proses diferensiasi. Respons seluler terhadap sitokin dan faktor pertumbuhan berbeda antara kondrosit yang tidak berdiferensiasi dan yang berdiferensiasi. IL-1 merangsang proliferasi fibroblas, sedangkan pertumbuhan kondrosit yang tidak berdiferensiasi dihambat oleh IL-1. Sintesis DNA dirangsang oleh IGF-1 pada kondrosit yang memanjang tetapi tidak pipih. Pada kondrosit yang berdiferensiasi, efek stimulasi IL-1beta dan TNF-a pada produksi prokolagenase lebih jelas daripada pada kondrosit yang tidak berdiferensiasi.

Budidaya Kondrosit

Kultivasi kondrosit dalam suspensi dalam media cair atau dalam matriks tiga dimensi alami atau sintetis menstabilkan fenotipe kondrosit. Sel-sel mempertahankan bentuk bulatnya dan mensintesis protein spesifik jaringan. Kultur kondrosit yang tersuspensi biasanya direkomendasikan untuk mempelajari pembentukan matriks periseluler baru. Kultur kondrosit dalam polimer penyerap sintetis atau alami digunakan untuk implantasi sel ke dalam defek tulang rawan untuk merangsang regenerasi jaringan tulang rawan sendi. Media sintetis atau alami untuk sel yang diimplan harus memenuhi sejumlah persyaratan:

• implan harus memiliki struktur berpori untuk adhesi dan pertumbuhan sel,
• baik polimer itu sendiri maupun produk degradasinya tidak boleh menyebabkan peradangan atau reaksi toksik ketika ditanamkan secara in vivo,
• pembawa cangkok harus memiliki kemampuan untuk mengikat tulang rawan yang berdekatan atau tulang subkondral,
• matriks alami atau sintetis harus memiliki kemampuan untuk menyerap, degradasinya harus diimbangi dengan regenerasi jaringan,
• untuk memfasilitasi perbaikan tulang rawan, struktur kimia dan arsitektur pori matriks harus memfasilitasi pemeliharaan fenotipe seluler dan sintesis protein spesifik jaringan oleh kondrosit yang ditempatkan di dalamnya,
• Selama implantasi in vivo, perlu dipelajari sifat mekanik matriks sintetis atau alami.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Suspensi kondrosit dalam fase cair

Penempelan sel pada pembuluh plastik tempat kondrosit dikultur dapat dicegah dengan melapisi dindingnya dengan larutan metilselulosa, agarosa, hidrogel (poli-2-hidroksi etil metakrilat), atau campuran kolagen-agarosa. Dalam kondisi ini, kondrosit membentuk gugusan dan mensintesis terutama kolagen agrekan dan kolagen spesifik jaringan (tipe II, IX, XI). Dua tipe sel biasanya ditemukan. Sel-sel yang terletak di bagian tengah mempertahankan bentuk bulat dan dikelilingi oleh ECM yang berkembang dengan baik, yang dikonfirmasi oleh studi histokimia dan ultrastruktural. Di bagian tepi, kondrosit memiliki garis luar berbentuk cakram dan dikelilingi oleh ECM yang jarang; sedikit yang diketahui tentang karakteristik fungsional sel-sel tersebut.

Kondrosit dapat dikulturkan pada mikropembawa yang disimpan dalam suspensi; manik dekstran (cytodex), manik dekstran berlapis kolagen (cytodex III), dan mikrosfer non-pori kolagen tipe I (cellagen) digunakan sebagai mikropembawa. Dalam kondisi kultur ini, kondrosit menempel pada permukaan mikropembawa, mempertahankan bentuk bulatnya, dan menghasilkan bahan seperti matriks. Selain itu, penggunaan cellagen mendorong proliferasi kondrosit dan ekspresi ulang fenotipe normal. Oleh karena itu, kultur kondrosit pada mikrosfer cellagen dapat digunakan untuk memulihkan fenotipe sel sebelum transplantasi.

Metode lain untuk membudidayakan suspensi kondrosit dalam media cair adalah membudidayakannya dalam bentuk bola padat yang terdiri dari sel-sel (0,5-1 * 10 ^b ), yang diperoleh dengan sentrifugasi. Kondrosit tersebut mampu menghasilkan matriks yang mengandung sejumlah besar proteoglikan, kolagen tipe II, tetapi bukan kolagen tipe I, yang dikonfirmasi dengan metode histologis, imunohistokimia, dan kuantitatif.

Suspensi kondrosit dalam ECM alami

Kondrosit dapat dikultur dalam suspensi dalam matriks tiga dimensi (agar lunak, agarosa, gel atau spons kolagen, asam hialuronat, lem fibrin, manik-manik alginat).

Kondrosit yang dikultur dalam agarosa mempertahankan fenotipe normalnya dan mensintesis kolagen tipe II dan agregat agrekan spesifik jaringan. Ketika dikultur dalam agarosa, proteoglikan yang disintesis oleh sel dilepaskan ke dalam medium selama 50 hari. Sebagai perbandingan, dalam kultur monolapis, fase seluler terisi penuh dengan glikosaminoglikan bahkan dalam 5-6 hari pertama kultur; ketika dikultur dalam medium, setelah peningkatan sintesis dan pelepasan glikosaminoglikan dalam 8-10 hari pertama, terjadi penurunan yang bergantung pada waktu. Meskipun demikian, perilaku kondrosit ketika dikultur dalam agarosa berbeda dari yang in vivo. Dalam agarosa, sejumlah besar agregat agrekan yang disintesis mengandung molekul yang lebih kecil dan lebih sedikit molekul daripada in vivo. TGF-β merangsang sintesis proteoglikan dalam eksplan, tetapi mengurangi sintesis agrekan dalam agarosa.

Alginat adalah polisakarida linier yang diperoleh dari rumput laut cokelat. Dengan adanya kation divalen, seperti ion Ca ²⁺, polimer ini berubah menjadi gel. Setiap kondrosit yang terperangkap dalam alginat dikelilingi oleh matriks polisakarida bermuatan negatif, yang pori-porinya sebanding dengan pori-pori pada tulang rawan hialin. Matriks yang dibentuk oleh kondrosit dalam butiran alginat terdiri dari dua kompartemen - lapisan tipis matriks terkait sel yang sesuai dengan matriks periseluler dan teritorial tulang rawan artikular dan matriks yang lebih jauh yang setara dengan interteritorial pada jaringan asli. Pada hari ke-30 kultur, volume relatif dan absolut yang ditempati oleh sel-sel dan masing-masing dari dua kompartemen dalam butiran alginat hampir sepenuhnya identik dengan yang ada pada tulang rawan asli. Selama hampir 30 hari, kondrosit mempertahankan bentuk bulatnya dan menghasilkan agrekan, yang sifat hidrodinamiknya mirip dengan molekul agrekan dalam matriks tulang rawan artikular, serta molekul kolagen tipe II, IX, dan XI. Pada saat yang sama, seperti kultur suspensi lainnya, sel-sel pipih hadir pada permukaan manik-manik alginat, yang menghasilkan sejumlah kecil molekul kolagen tipe I, yang dilepaskan langsung ke dalam medium dan tidak dimasukkan ke dalam ECM. Proliferasi kondrosit sedang diamati dalam manik-manik alginat. Setelah 8 bulan budidaya dalam gel alginat, kondrosit dewasa tidak kehilangan aktivitas metabolik dan terus mensintesis kolagen tipe II dan agrekan spesifik jaringan.

H. Tanaka dkk. (1984) menyelidiki sifat difusi berbagai molekul alami dalam alginat dan menemukan bahwa molekul yang lebih besar dari 70 kDa tidak berdifusi melalui alginat. Dengan demikian, kultur sel dalam alginat cocok untuk mempelajari regulasi biosintesis matriks dan organisasi ECM. Ketersediaan sel yang dikultur dalam alginat memungkinkan seseorang untuk mempelajari aksi faktor pengatur peptida dan agen farmakologis pada tingkat transkripsi, pascatranskripsi, dan translasi.

Kondrosit juga dikultur dalam matriks serat kolagen tipe I dan II. S. Nehrer dkk. (1997) membandingkan fungsi kondrosit anjing dalam matriks polimer kolagen-proteoglikan berpori yang mengandung kolagen dari berbagai tipe. Mereka menemukan perbedaan penting dalam morfologi fungsi biosintesis kondrosit yang dikultur dalam matriks kolagen yang mengandung kolagen tipe I dan II. Sel dalam matriks kolagen tipe II mempertahankan bentuk bulatnya, sedangkan dalam kolagen tipe I mereka memiliki morfologi seperti fibroblas. Selain itu, dalam matriks kolagen tipe II, kondrosit menghasilkan lebih banyak glikosaminoglikan. J. van Susante dkk. (1995) membandingkan sifat kondrosit yang dikultur dalam alginat dan gel kolagen (tipe I). Penulis menemukan peningkatan yang signifikan dalam jumlah sel dalam gel kolagen, tetapi sejak hari ke-6 kultur sel kehilangan fenotipe karakteristiknya, berubah menjadi sel seperti fibroblas. Pada gel alginat, terjadi penurunan jumlah sel, tetapi kondrosit mempertahankan fenotipe normalnya. Pada gel kolagen, jumlah proteoglikan per sel secara signifikan lebih tinggi daripada pada alginat, tetapi pada gel terjadi penurunan sintesis elemen matriks, mulai dari hari ke-6 kultivasi, sedangkan pada alginat sintesisnya terus meningkat.

Matriks fibrin padat tiga dimensi merupakan zat alami yang mendukung kondrosit yang tersuspensi di dalamnya dalam fenotipe yang terdiferensiasi. Matriks fibrin tiga dimensi juga dapat digunakan sebagai pembawa dalam transplantasi kondrosit. Keunggulan fibrin adalah tidak adanya sitotoksisitas, kemampuan untuk mengisi ruang, dan kapasitas adhesif. Studi histologis dan biokimia, autoradiografi, dan mikroskopi elektron telah menunjukkan bahwa kondrosit dalam gel fibrin mempertahankan morfologinya, berkembang biak, dan menghasilkan matriks bahkan setelah 2 minggu kultivasi. Namun, G. Homminga dkk. (1993) melaporkan bahwa disintegrasi fibrin dimulai setelah 3 hari kultivasi, dan dediferensiasi kondrosit berlanjut.

Suspensi kondrosit dalam ECM buatan (sintetis)

Implan tulang rawan untuk bedah rekonstruksi atau ortopedi dapat diperoleh dengan menumbuhkan kondrosit terisolasi secara in vitro dalam matriks biokompatibel sintetis.

Kondrosit yang dikultur dalam asam poliglikolat berproliferasi dan mempertahankan morfologi dan fenotipe normal selama 8 minggu. Kompleks kondrosit-asam poliglikolat terdiri dari sel, glikosaminoglikan, kolagen, dan memiliki kapsul kolagen eksternal. Namun, implan tersebut mengandung dua jenis molekul kolagen - I dan II. Implan dari kondrosit yang didedifferensiasi oleh serangkaian saluran memiliki jumlah glikosaminoglikan dan kolagen yang lebih banyak daripada implan dari kondrosit yang sebagian besar tidak berdiferensiasi.

L. Freed dkk. (1993b) membandingkan perilaku kultur kondrosit manusia dan sapi dalam asam poliglikolat berserat (FPGA) dan asam polilaktat berpori (PPLA). Setelah 6-8 minggu mengkultur kondrosit sapi dalam FPGA atau PPLA, penulis mengamati proliferasi sel dan regenerasi matriks tulang rawan. Dalam FPGA, kondrosit memiliki bentuk bulat dan terletak di lakuna yang dikelilingi oleh matriks tulang rawan. Setelah 8 minggu kultur in vitro, jaringan yang diregenerasi mengandung hingga 50% bahan kering (4% massa seluler, 15% glikosaminoglikan, dan 31% kolagen). Dalam PPLA, sel-sel memiliki bentuk seperti gelendong dan sejumlah kecil glikosaminoglikan dan kolagen. Dalam FPGA, pertumbuhan sel 2 kali lebih intens daripada dalam PPLA. In vivo, kondrosit yang tumbuh dalam VPGK dan PPLC menghasilkan jaringan yang secara histologis mirip dengan tulang rawan dalam waktu 1-6 bulan. Implan mengandung glikosaminoglikan, kolagen tipe I dan II.

Kondrosit janin sapi dikulturkan dalam polietilena hidrofobik dan hidrofilik berpori dengan kepadatan tinggi. Setelah 7 hari inkubasi di kedua substrat, sel-sel tersebut mempertahankan bentuk bulat dan sebagian besar mengandung kolagen tipe II. Setelah 21 hari kultur, matriks hidrofilik ditemukan mengandung lebih banyak kolagen tipe II daripada matriks hidrofobik.

Jaringan tulang rawan juga dapat diperoleh dengan cara membudidayakan dalam satu lapisan pada filter Millicell-CM. Pelapisan awal filter dengan kolagen diperlukan untuk pelekatan kondroitin. Pemeriksaan histologis kultur menunjukkan akumulasi kondrosit dalam ECM yang mengandung proteoglikan dan kolagen tipe II. Kolagen tipe I tidak terdeteksi dalam kultur tersebut. Kondrosit dalam jaringan tulang rawan yang diperoleh berbentuk bulat, tetapi pada permukaan jaringan agak pipih. Ketebalan jaringan yang baru terbentuk meningkat seiring waktu dan bergantung pada kepadatan awal satu lapisan sel. Dalam kondisi kultur yang optimal, ketebalan jaringan tulang rawan mencapai 110 μm, organisasi sel dan kolagennya menjadi lapisan superfisial dan dalam mirip dengan tulang rawan artikular. ECM mengandung sekitar 3 kali lebih banyak kolagen dan proteoglikan. Setelah 2 minggu pembudidayaan, akumulasi matriks diamati, yang memungkinkan jaringan diekstraksi dari filter dan digunakan untuk transplantasi.

Sims dkk. (1996) mempelajari pembudidayaan kondrosit dalam gel polietilen oksida, matriks polimer berkapsul yang memungkinkan pemindahan sejumlah besar sel melalui injeksi. Enam minggu setelah injeksi ke jaringan subkutan tikus atimik, tulang rawan baru terbentuk, yang secara morfologis dicirikan oleh opalesensi putih yang mirip dengan tulang rawan hialin. Data histologis dan biokimia menunjukkan adanya kondrosit yang berproliferasi aktif yang menghasilkan ECM.

Penjelasan

Eksplantasi jaringan tulang rawan digunakan untuk mempelajari proses ana- dan katabolisme di dalamnya, pemeliharaan homeostasis, resorpsi dan perbaikan. Kondrosit dalam eksplant tulang rawan mempertahankan fenotipe normal dan komposisi ECM yang mirip dengan yang ada di tulang rawan artikular secara in vivo. Setelah 5 hari kultur dengan adanya serum, tingkat sintesis dan proses degradasi alami yang konstan tercapai. Resorpsi jaringan dapat dipercepat dalam kultur utama dan dalam kultur dengan penambahan serum menggunakan sejumlah agen, seperti IL-IB, TNF-a, lipopolisakarida bakteri, turunan asam retinoat atau radikal oksigen aktif. Untuk mempelajari perbaikan tulang rawan, kerusakannya diinduksi oleh mediator inflamasi terlarut (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) atau ruptur fisik matriks.

Metode kultur organotipik merupakan model untuk studi in vitro tentang efek faktor eksternal yang terisolasi pada kondrosit dan matriks di sekitarnya. In vivo, kondrosit jarang ditemukan di ECM dan tidak saling bersentuhan. Kultur eksplant tulang rawan artikular mempertahankan organisasi struktural ini, serta interaksi spesifik antara kondrosit dan lingkungan ekstraseluler di sekitarnya. Model ini juga digunakan untuk mempelajari efek stres mekanis, agen farmakologis, faktor pertumbuhan, sitokin, dan hormon pada metabolisme tulang rawan.

Keuntungan lain dari eksplantasi jaringan tulang rawan adalah tidak adanya kerusakan pada kondrosit akibat aksi enzim proteolitik atau faktor mekanis, yang tidak dapat dihindari saat mengisolasi sel. Reseptor dan protein membran serta glikoprotein lainnya terlindungi dari faktor yang merusak.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ], [ 21 ]

Budaya chondron

Kondron merupakan unit struktural, fungsional, dan metabolik tulang rawan artikular yang terdiri dari kondrosit, matriks periselulernya, dan kapsul filamen padat yang bertanggung jawab atas homeostasis matriks. Kondron diekstraksi secara mekanis dari tulang rawan dan dikumpulkan menggunakan beberapa homogenisasi kecepatan rendah yang berurutan. Kondron yang diisolasi dari zona dengan kedalaman tulang rawan yang berbeda dapat dibagi menjadi empat kategori: kondron tunggal, kondron berpasangan, beberapa (tiga atau lebih) kondron yang tersusun secara linier (kolom kondron), dan gugusan kondron.

Kondron tunggal biasanya ditemukan di lapisan tengah tulang rawan utuh, kondron berpasangan ditemukan di perbatasan lapisan tengah dan dalam, kondron ganda yang tersusun secara linier merupakan ciri khas lapisan dalam tulang rawan utuh. Terakhir, gugusan kondron terdiri dari kelompok kondron tunggal dan berpasangan yang tersusun secara acak, yang mempertahankan keadaan agregat setelah homogenisasi. Gugusan kondron merupakan fragmen tulang rawan yang besar, biasanya mengandung beberapa kondron dan fibril kolagen yang tersusun secara radial, yaitu, karakteristik organisasi khas lapisan dalam matriks. Kondron diimobilisasi dalam agarosa transparan, yang memungkinkan untuk mempelajari struktur, komposisi molekuler, dan aktivitas metaboliknya. Sistem kondron-agarosa dianggap sebagai mikromodel tulang rawan, yang berbeda dari sistem kondrosit-agarosa tradisional karena lingkungan mikro alami dipertahankan, dan tidak perlu mensintesis dan merakitnya. Kultur kondron merupakan model untuk mempelajari interaksi sel dan matriks dalam tulang rawan artikular dalam kondisi normal dan patologis.

[ 22 ], [ 23 ], [ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ]

Budaya kondrosit abadi

DNA rekombinan atau virus yang mengandung onkogen yang mampu membuat sel menjadi "abadi" digunakan untuk membuat garis sel permanen. Kondrosit abadi memiliki kemampuan untuk berkembang biak tanpa henti sambil mempertahankan fenotipe yang stabil. F. Mallein-Gerin dkk. (1995) menunjukkan bahwa onkogen SV40T menginduksi proliferasi kondrosit tikus, yang terus mengekspresikan kolagen tipe II, IX, dan XI secara stabil, serta agrekan artikular dan protein pengikat. Namun, garis sel tersebut memperoleh kemampuan untuk mensintesis kolagen tipe I saat membudidayakannya dalam kultur monolapis atau dalam gel agarosa.

W. Horton dkk. (1988) menggambarkan sederet sel immortal dengan tingkat ekspresi mRNA kolagen tipe II yang rendah. Sel-sel ini diperoleh melalui transformasi dengan retrovirus tikus yang mengandung onkogen I-myc dan y-ra. Jenis sel ini merupakan model unik untuk mempelajari interaksi matriks artikular tanpa adanya kolagen tipe II, serta regulasi sintesis kolagen tipe II.

Kultur kondropit dengan gen yang bermutasi atau dihapus merupakan model yang mudah digunakan untuk mempelajari fungsi fisiologisnya. Model ini khususnya cocok untuk mempelajari peran molekul spesifik dalam organisasi matriks tulang rawan atau untuk menyelidiki efek berbagai faktor pengatur pada metabolisme tulang rawan. Kondrosit dengan gen yang dihapus untuk kolagen tipe IX mensintesis fibril kolagen yang lebih lebar dari biasanya, yang menunjukkan bahwa kolagen tipe IX mengatur diameter fibril. Seperti yang dicatat dalam Bab 1, mutasi pada gen COLAI yang mengkode kolagen tipe II baru-baru ini ditemukan pada keluarga dengan osteoartritis umum primer. Untuk mempelajari efek kolagen tipe II mutan pada matriks artikular, R. Dharmrvaram et al. (1997) mentransfeksi (terinfeksi dengan asam nukleat asing) COL ₂ AI yang rusak (arginin pada posisi 519 digantikan oleh sistein) ke dalam kondrosit janin manusia secara in vitro.

Sistem kokultur. Di dalam sendi, tulang rawan berinteraksi dengan jenis sel lain yang terdapat dalam membran sinovial, cairan sinovial, ligamen, dan tulang subkondral. Metabolisme kondrosit dapat dipengaruhi oleh berbagai faktor terlarut yang disintesis oleh sel-sel yang tercantum. Jadi, pada artritis, tulang rawan artikular dihancurkan oleh enzim proteolitik dan radikal bebas yang diproduksi oleh sel-sel sinovial. Oleh karena itu, model telah dikembangkan untuk mempelajari interaksi kompleks antara tulang rawan dan jaringan di sekitarnya, yang disebut kokultur.

S. Lacombe-Gleise dkk. (1995) membudidayakan kondrosit dan osteoblas kelinci dalam sistem kokultur (COSTAR) di mana sel-sel dipisahkan oleh membran mikropori (0,4 μm) yang memungkinkan terjadinya pertukaran antara kedua jenis sel tersebut tanpa kontak langsung. Penelitian ini menunjukkan kemampuan osteoblas untuk merangsang pertumbuhan kondrosit melalui mediator terlarut.

AM Malfait dan rekan penulis (1994) mempelajari hubungan antara monosit darah tepi dan kondrosit. Model ini berguna untuk mempelajari proses yang dimediasi sitokin dalam artropati inflamasi (artritis reumatoid, spondiloartritis seronegatif, dll.). Penulis model memisahkan sel-sel dengan membran pengikat protein dengan pori-pori berdiameter 0,4 μm. Studi menunjukkan bahwa monosit yang distimulasi dengan lipopolisakarida menghasilkan IL-1 dan TNF-a, yang menghambat sintesis agrekan oleh kondrosit dan berkontribusi terhadap degradasi agregat agrekan yang telah disintesis.

K. Tada dkk. (1994) membuat model kokultur di mana sel-sel endotel dalam gel kolagen (tipe I) ditempatkan di ruang dalam yang terpisah dari ruang luar dengan kondrosit ditempatkan di dalamnya oleh filter dengan ukuran pori 0,4 μm. Dalam keadaan isolasi lengkap dari ruang luar, sel-sel endotel manusia membentuk tabung dalam gel kolagen dengan adanya EGF atau TGF-a. Ketika kedua jenis sel dikultur secara bersamaan, pembentukan tabung yang bergantung pada TGF-a oleh sel-sel endotel dihambat. Penghambatan proses ini oleh kondrosit sebagian dihilangkan oleh antibodi anti-TGF-beta. Dapat diasumsikan bahwa TGF-beta yang diproduksi oleh kondrosit menghambat vaskularisasi tulang rawan itu sendiri.

S. Groot dkk. (1994) secara simultan membudidayakan kondrosit dari zona hipertrofik dan proliferatif tulang janin tikus berusia 16 hari dengan potongan jaringan otak. Setelah 4 hari pembudidayaan, transdiferensiasi kondrosit menjadi osteoblas dan awal pembentukan osteoid diamati. Setelah 11 hari pembudidayaan, sebagian tulang rawan digantikan oleh jaringan tulang dan matriks tulang mengalami kalsifikasi sebagian. Beberapa neuropeptida dan neurotransmiter yang diproduksi oleh jaringan otak memengaruhi metabolisme osteoblas atau memiliki reseptor untuknya. Di antaranya adalah norepinefrin, peptida intestinal vasoaktif, peptida terkait gen kalsitonin, substansi P, dan somatostatin. Potongan jaringan otak yang dikultur bersama dengan kondrosit dapat menghasilkan beberapa faktor yang tercantum yang mampu menginduksi proses transdiferensiasi kondrosit menjadi osteoblas.

[ 28 ], [ 29 ], [ 30 ], [ 31 ], [ 32 ], [ 33 ]

Pengaruh faktor eksternal terhadap kultur kondrosit

Pengaruh ketegangan oksigen terhadap metabolisme kondrosit

Dalam kebanyakan kasus, kultur kondrosit berkembang dalam kondisi tekanan oksigen atmosfer. Akan tetapi, diketahui bahwa kondrosit in vivo hidup dalam kondisi hipoksia dan tekanan oksigen bervariasi dalam berbagai kondisi patologis. Selama proses pematangan, terjadi perubahan signifikan dalam suplai darah ke epifisis. Karena vaskularisasi bervariasi di berbagai zona lempeng pertumbuhan, tekanan oksigen di dalamnya juga bervariasi. C. Brighton dan R. Heppenstall (1971) menunjukkan bahwa pada lempeng tibialis kelinci, tekanan oksigen di zona hipertrofik lebih rendah daripada di tulang rawan di sekitarnya. Pengukuran beberapa parameter metabolik menunjukkan bahwa kondrosit mampu merespons dengan cepat perubahan lokal dalam konsentrasi oksigen. Pertama-tama, pada tekanan oksigen rendah, konsumsinya oleh kondrosit menurun. Dengan penurunan tekanan oksigen dari 21 menjadi 0,04%, penggunaan glukosa meningkat, aktivitas enzim glikolitik dan sintesis asam laktat meningkat. Bahkan pada tekanan oksigen rendah, jumlah absolut ATP, ADP, dan AMP tetap stabil. Data ini menunjukkan bahwa metabolisme kondrosit ditujukan untuk konservasi energi secara maksimal. Namun, aktivitas sintetis, dan dengan demikian proses perbaikan, berubah dalam kondisi hipoksia.

Tekanan oksigen yang tinggi juga memengaruhi metabolisme kondrosit, yang menyebabkan penurunan sintesis proteoglikan dan DNA serta degradasi matriks tulang rawan. Efek ini biasanya disertai dengan produksi radikal oksigen bebas.

Pengaruh Konsentrasi Ion dan Tekanan Osmotik Lingkungan terhadap Fungsi Kondrosit

Pada tulang rawan asli, konsentrasi ion berbeda secara signifikan dari yang ada di jaringan lain: kandungan natrium dalam media ekstraseluler adalah 250-350 mmol, dan osmolalitasnya adalah 350-450 mosmol. Ketika kondrosit diisolasi dari ECM dan diinkubasi dalam media standar (DMEM (Dulbecco's Minimal Essential Medium), osmolalitasnya adalah 250-280,7 mosmol), lingkungan di sekitar sel berubah secara dramatis. Selain itu, konsentrasi kalsium dan kalium dalam media standar secara signifikan lebih rendah daripada di jaringan asli, dan konsentrasi anion secara signifikan lebih tinggi.

Penambahan sukrosa ke dalam medium meningkatkan osmolaritasnya dan menginduksi peningkatan intraseluler sementara dalam konsentrasi anion H ⁺ dan kalsium dalam sitosol. Perubahan intraseluler tersebut dapat memengaruhi proses diferensiasi kondrosit dan aktivitas metaboliknya. J. Urban dkk. (1993) menemukan bahwa penggabungan ³⁵ 8-sulfat dan ³ H-prolin oleh kondrosit terisolasi yang diinkubasi dalam DMEM standar selama 2-4 jam hanya 10% dari yang ada di jaringan asli. Intensitas sintesis mencapai maksimum pada osmolaritas medium ekstraseluler 350-400 mosmol baik pada kondrosit yang baru diisolasi maupun pada eksplan jaringan tulang rawan. Selain itu, volume kondrosit meningkat 30-40% setelah menempatkan sel yang diisolasi dalam DMEM standar dengan osmolaritas yang ditentukan. Namun, ketika membudidayakan kondrosit dalam kondisi osmolaritas non-fisiologis selama 12-16 jam, sel beradaptasi dengan kondisi baru, mengurangi intensitas biosintesis sebanding dengan pergeseran osmolaritas lingkungan ekstraseluler.

P. Borgetti dkk. (1995) mempelajari efek osmolaritas media ekstraseluler terhadap pertumbuhan, morfologi, dan biosintesis kondrosit babi. Para penulis menunjukkan ciri biokimia dan morfologi yang serupa dari kondrosit yang dikultur dalam media dengan osmolaritas 0,28 dan 0,38 mosmol. Pada osmolaritas media 0,48 mosmol, penurunan proliferasi sel dan sintesis protein diamati selama 4-6 jam pertama kultivasi, tetapi parameter ini kemudian pulih dan akhirnya mencapai nilai kontrol. Ketika kondrosit dikultur dalam media dengan osmolaritas 0,58 mosmol, sel-sel kehilangan kemampuan untuk mempertahankan intensitas fisiologis proses proliferatif, dan setelah 6 hari jumlah kondrosit berkurang secara signifikan. Pada osmolaritas media 0,58 mosmol, penghambatan sintesis protein yang mendalam diamati. Selain itu, ketika dikulturkan dalam media dengan osmolaritas 0,28-0,38 mOsm, kondrosit mempertahankan fenotipe fisiologisnya; pada osmolaritas yang lebih tinggi (0,48-0,58 mOsm), terjadi perubahan signifikan dalam morfologi sel, yang dimanifestasikan oleh hilangnya fenotipe karakteristik, transformasi kondrosit menjadi sel-sel seperti fibroblas, dan hilangnya kemampuan sel untuk merakit proteoglikan matriks. Hasil penelitian ini menunjukkan kemampuan kondrosit untuk merespons fluktuasi terbatas dalam osmolaritas lingkungan ekstraseluler.

Perubahan dalam konsentrasi ion lain juga dapat mempengaruhi proses biosintesis dalam kondrosit. Dengan demikian, derajat penggabungan ³⁵ S (sulfat) meningkat setengahnya dengan peningkatan konsentrasi ion kalium dari 5 mmol (konsentrasi dalam medium EM DM standar) menjadi 10 mmol (konsentrasi dalam ECM in vivo). Konsentrasi kalsium di bawah 0,5 mmol mendorong produksi kolagen oleh kondrosit sapi dewasa, sementara konsentrasi 1-2 mmol (sesuai dengan konsentrasi dalam medium EM DM standar) menyebabkan penurunan yang signifikan dalam sintesis kolagen. Peningkatan sedang dalam biosintesis diamati pada kadar kalsium tinggi (2-10 mmol). Berbagai kation berpartisipasi dalam perlekatan kondrosit ke protein ECM. Dengan demikian, ion magnesium dan mangan memberikan perlekatan pada fibronektin dan kolagen tipe II, sementara ion kalsium tidak berpartisipasi dalam perlekatan kondrosit ke protein. Dengan demikian, hasil penelitian yang dijelaskan menunjukkan pengaruh perubahan ion ekstraseluler kalium, natrium, kalsium dan osmolalitas media terhadap fungsi biosintesis kondrosit yang diinkubasi dalam media standar.

Pengaruh stres mekanik terhadap metabolisme kondrosit

Imobilisasi sendi menyebabkan atrofi tulang rawan reversibel, yang menunjukkan perlunya rangsangan mekanis untuk proses metabolisme normal di ECM. Dalam kebanyakan kasus, model kultur sel yang digunakan ada di bawah tekanan atmosfer normal. M. Wright et al. (1996) menunjukkan bahwa lingkungan mekanis memengaruhi metabolisme kondrosit, respons sel bergantung pada intensitas dan frekuensi pembebanan kompresif. Eksperimen dengan pembebanan pada eksplan tulang rawan artikular utuh secara in vitro menunjukkan penurunan sintesis protein dan proteoglikan di bawah aksi pembebanan statis, sementara pembebanan dinamis merangsang proses ini. Mekanisme pasti dari efek pembebanan mekanis pada tulang rawan bersifat kompleks dan mungkin terkait dengan deformasi sel, tekanan hidrostatik, tekanan osmotik, potensial listrik, dan reseptor seluler permukaan untuk molekul matriks. Untuk mempelajari efek dari masing-masing parameter ini, perlu dibuat sistem di mana satu parameter dapat divariasikan secara independen. Misalnya, kultur eksplan tidak cocok untuk mempelajari deformasi sel, tetapi dapat digunakan untuk mempelajari efek umum tekanan pada aktivitas metabolisme kondrosit. Kompresi tulang rawan menyebabkan deformasi sel dan juga disertai dengan munculnya gradien tekanan hidrostatik, potensial listrik, aliran fluida, dan perubahan parameter fisikokimia seperti kadar air dalam matriks, kerapatan muatan listrik, dan tingkat tekanan osmotik. Deformasi sel dapat dipelajari menggunakan kondrosit terisolasi yang direndam dalam gel agarosa atau kolagen.

Beberapa sistem telah dikembangkan untuk mempelajari efek stimulasi mekanis pada kultur kondrosit. Beberapa peneliti menggunakan sistem di mana tekanan diterapkan pada kultur sel melalui fase gas. Dengan demikian, JP Veldhuijzen dkk. (1979), menggunakan tekanan 13 kPa di atas atmosfer dengan frekuensi rendah (0,3 Hz) selama 15 menit, mengamati peningkatan sintesis cAMP dan proteoglikan dan penurunan sintesis DNA. R. Smith dkk. (1996) menunjukkan bahwa paparan intermiten kultur kondrosit sapi primer terhadap tekanan hidrostatik (10 MPa) dengan frekuensi 1 Hz selama 4 jam menyebabkan peningkatan sintesis aggrekan dan kolagen tipe II, sedangkan tekanan konstan tidak memengaruhi proses ini. Menggunakan sistem yang serupa, Wright dkk. (1996) melaporkan bahwa tekanan siklik pada kultur sel dikaitkan dengan hiperpolarisasi membran sel kondrosit dan aktivasi saluran kalium yang bergantung pada Ca2 ⁺. Dengan demikian, efek tekanan siklik dimediasi oleh saluran ion yang diaktifkan oleh peregangan di membran kondrosit. Respons kondrosit terhadap tekanan hidrostatik bergantung pada kondisi kultur sel dan frekuensi beban yang diberikan. Dengan demikian, tekanan hidrostatik siklik (5 MPa) menurunkan penggabungan sulfat ke dalam lapisan tunggal kondrosit pada frekuensi 0,05, 0,25, dan 0,5 Hz, sedangkan pada frekuensi lebih besar dari 0,5 Hz, penggabungan sulfat ke dalam eksplant tulang rawan meningkat.

M. Bushmann dkk. (1992) melaporkan bahwa kondrosit dalam gel agarosa mengubah biosintesis sebagai respons terhadap pembebanan mekanis statis dan dinamis dengan cara yang sama seperti organ utuh yang dikultur. Para penulis menemukan bahwa pembebanan mekanis menghasilkan stimulus hiperosmotik dengan penurunan pH berikutnya dalam kondrosit.

Efek peregangan mekanis dapat dipelajari pada kultur sel yang terbenam dalam gel. Gaya peregangan dapat dibuat menggunakan vakum yang dikontrol komputer. Ketika sistem berada di bawah tingkat vakum tertentu, bagian bawah cawan Petri dengan kultur sel diperpanjang dengan jumlah yang diketahui, deformasi maksimum di tepi bagian bawah cawan dan minimum di bagian tengah. Peregangan juga ditransmisikan ke kondrosit yang dikultur dalam cawan Petri. Dengan menggunakan metode ini, K. Holm-vall et al. (1995) menunjukkan bahwa dalam sel kondrosarkoma yang dikultur dalam gel kolagen (tipe II), ekspresi mRNA dari 2-integrin meningkat _{. 2 βintegrin} mampu _mengikat kolagen tipe II. Ini dianggap sebagai mekanoreseptor, karena berinteraksi dengan protein pengikat aktin, sehingga menghubungkan ECM dan sitoskeleton.

Pengaruh pH terhadap metabolisme kondrosit

PH cairan interstisial ECM jaringan tulang rawan lebih asam daripada di jaringan lain. A. Maroudas (1980) menentukan pH matriks tulang rawan artikular pada 6,9. B. Diamant dkk. (1966) menemukan pH 5,5 dalam kondisi patologis. Diketahui bahwa kondrosit hidup pada PO2 rendah, yang menunjukkan peran penting glikolisis (95% dari semua metabolisme glukosa) dalam metabolisme sel-sel ini; glikolisis disertai dengan produksi sejumlah besar asam laktat.

Selain pengasaman lingkungan oleh produk glikolisis, komponen matriks sendiri sangat penting. Jumlah besar muatan negatif tetap pada proteoglikan memodifikasi komposisi ion ekstraseluler: konsentrasi tinggi kation bebas (misalnya, H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) dan konsentrasi rendah anion (misalnya, O2, HCO3 ) diamati. Selain itu, di bawah pengaruh pembebanan mekanis, air dikeluarkan dari ECM, yang mengarah pada peningkatan konsentrasi muatan negatif tetap dan tarikan lebih banyak kation ke dalam matriks. Ini disertai dengan penurunan pH lingkungan ekstraseluler, yang memengaruhi pH intraseluler, sehingga memodifikasi metabolisme kondrosit. R. Wilkin dan A. Hall (1995) mempelajari pengaruh pH lingkungan ekstraseluler dan intraseluler pada biosintesis matriks oleh kondrosit sapi yang diisolasi. Mereka mengamati modifikasi ganda sintesis matriks dengan penurunan pH. Sedikit penurunan pH (7,435SO4 dan ^3H prolin ke dalam kondrosit, sedangkan pengasaman medium yang lebih dalam (pH<7,1) menghambat sintesis sebanyak 75% dibandingkan dengan kontrol. Pembuatan pH rendah (6,65 ) menggunakan ion amonium menyebabkan penurunan sintesis matriks hanya sebanyak 20%. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa modifikasi pH medium ekstraseluler sintesis matriks tidak dapat dijelaskan hanya dengan perubahan pH medium intraseluler. Selain itu, kondrosit memiliki kemampuan untuk mengatur pH intraseluler menggunakan penukar Na ⁺, H ^{+, transporter Cl_-} НСОС3 yang bergantung pada Ka ⁺, dan H ⁺ /ATPase.

[ 34 ], [ 35 ], [ 36 ], [ 37 ], [ 38 ], [ 39 ], [ 40 ]

Pengaruh komposisi media kultur terhadap metabolisme kondrosit

Media untuk membudidayakan kondrosit harus sesuai dengan kondisi percobaan. Dalam beberapa tahun terakhir, serum sapi telah digunakan untuk mengoptimalkan kondisi pembiakan. Namun, saat menggunakan serum, sejumlah poin penting harus diperhatikan:

• pertumbuhan sel keluar dari pinggiran jaringan dalam kultur organ,
• variabilitas dalam komposisi serum dari seri yang berbeda,
• adanya komponen yang tidak diketahui di dalamnya,
• peningkatan risiko gangguan dan artefak saat mempelajari pengaruh berbagai faktor biologis pada aktivitas metabolisme sel.

Contoh yang terakhir adalah studi tentang efek EGF pada kondrosit tulang rawan pada tikus. EGF menstimulasi penggabungan ^3H -timidin dan peningkatan kandungan DNA dalam kultur. Efek ini lebih jelas pada konsentrasi serum rendah (<1%), tetapi pada konsentrasi tinggi (>7,5%) efeknya menghilang.

Telah diketahui secara umum bahwa tingkat sintesis dan degradasi dalam DMEM yang disuplemenkan dengan serum anak sapi meningkat secara signifikan dibandingkan dengan kondisi in vivo. Perbedaan antara metabolisme in vivo dan in vitro mungkin disebabkan oleh perbedaan antara cairan sinovial dan medium tempat sel dikultur. Lee dkk. (1997) mengkulturkan kondrosit sapi muda dalam agarosa menggunakan medium nutrisi yang mengandung DMEM yang disuplemenkan dengan 20% serum anak sapi dan sejumlah besar cairan sinovial alogenik normal. Kehadiran cairan sinovial dalam medium menginduksi peningkatan jumlah proteoglikan, hingga 80% dari jumlah total cairan sinovial. Hasil ini menunjukkan bahwa cairan sinovial dalam kultur menginduksi tingkat metabolisme yang mirip dengan yang in vivo, dengan tingkat sintesis glikosaminoglikan yang tinggi dan tingkat pembelahan sel yang rendah.

G. Verbruggen dkk. (1995) menunjukkan bahwa sintesis ³⁵ S-arrpeKaHa oleh kondrosit manusia yang dikultur dalam agarosa dalam DMEM bebas serum adalah 20-30% dari tingkat sintesis yang diamati dalam DMEM yang disuplemen dengan 10% serum anak sapi. Para penulis menentukan sejauh mana IGF-1, IGF-2, TGF-R, atau insulin memulihkan produksi agrekan dalam medium bebas serum. Para penulis menyimpulkan bahwa 100 ng/ml insulin, IGF-1, atau IGF-2 memulihkan sebagian sintesis agrekan hingga 39-53% dari tingkat kontrol. Tidak ada sinergisme atau kumulasi yang diamati dengan kombinasi faktor-faktor yang tercantum. Pada saat yang sama, 10 ng/ml TGF-R dengan adanya 100 ng/ml insulin merangsang sintesis agrekan hingga 90% atau lebih dari tingkat referensi. Akhirnya, transferin serum manusia, sendiri atau dalam kombinasi dengan insulin, tidak memengaruhi sintesis agrekan. Ketika serum sapi diganti dengan albumin serum sapi, kandungan agregat agrekan menurun secara signifikan. Pengayaan media kultur dengan insulin, IGF, atau TGF-R sebagian memulihkan kemampuan sel untuk menghasilkan agregat agrekan. Selain itu, IGF-1 dan insulin mampu mempertahankan homeostasis dalam kultur sel. Setelah 40 hari budidaya dalam media yang diperkaya dengan 10-20 ng/ml IGF-1, sintesis proteoglikan dipertahankan pada tingkat yang sama atau bahkan lebih tinggi dibandingkan dengan media yang mengandung 20% serum sapi. Proses katabolik berlangsung lebih lambat dalam media yang diperkaya dengan IGF-1 dibandingkan dalam media yang diperkaya dengan larutan albumin 0,1%, tetapi agak lebih cepat dalam media yang diperkaya dengan serum 20%. Dalam kultur yang berumur panjang, 20 ng/ml IGF-1 mempertahankan keadaan sel yang stabil.

D. Lee dkk. (1993) membandingkan efek komposisi medium kultur (DMEM, DMEM+20% calf serum, DMEM+20 ng/ml IGF-1) pada sintesis DNA dalam kultur eksplant jaringan tulang rawan, kultur monolapis, dan suspensi agarosa. Ketika mengkultur dalam agarosa dengan adanya serum, penulis mengamati kecenderungan kondrosit untuk berkelompok menjadi gugusan besar. Sel yang dikultur tanpa serum atau dengan IGF-1 mempertahankan bentuk bulat dalam agarosa, terkumpul menjadi kelompok-kelompok kecil, tetapi tidak membentuk agregat besar. Dalam monolapis, sintesis DNA secara signifikan lebih tinggi dalam medium yang mengandung serum daripada dalam medium yang diperkaya dengan IGF-1; sintesis DNA dalam yang terakhir secara signifikan lebih tinggi daripada dalam medium yang tidak diperkaya. Tidak ditemukan perbedaan dalam sintesis DNA ketika kondrosit dikultur dalam suspensi agarosa dalam medium yang tidak diperkaya dan dalam medium dengan IGF-1. Pada saat yang sama, pembiakan suspensi kondrosit dalam agarosa dalam media yang diperkaya serum disertai dengan peningkatan penggabungan radionukleotida ³ H-timidin dibandingkan dengan media lain.

Vitamin C diperlukan untuk aktivasi enzim yang terlibat dalam pembentukan struktur heliks yang stabil dari fibril kolagen. Kondrosit yang kekurangan asam askorbat mensintesis prekursor kolagen non-heliks yang kurang terhidroksilasi, yang disekresikan secara perlahan. Pemberian asam askorbat (50 μg/ml) menyebabkan hidroksilasi kolagen tipe II dan IX dan sekresinya dalam jumlah normal. Penambahan vitamin C tidak mempengaruhi tingkat sintesis proteoglikan. Oleh karena itu, sekresi kolagen diatur secara independen dari sekresi proteoglikan.

[ 41 ], [ 42 ], [ 43 ], [ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ]