Sel induk embrionik

Penemuan sel induk embrionik - muncul tidak secara tidak sengaja, namun muncul di lahan penelitian ilmiah yang disiapkan di bidang biologi perkembangan. Istilah "stem cell" diperkenalkan ke dalam obat sejauh 1908 di kongres masyarakat hematologi di Berlin oleh Alexander Maksimov sehubungan dengan sel hematopoietik. Jauh sebelum isolasi dan persiapan garis stabil sel induk embrionik pluripoten dalam pengembangan awal dari proses penelitian yang digunakan batang terato- (sel embrio-karsinoma dengan yang mempelajari mekanisme yang tidak diketahui embriogenesis, termasuk urutan ekspresi gen awal dan produk protein dari pekerjaan mereka.

Tapi apakah totipotency genom manusia bisa hilang dalam proses evolusi? Tidak, dan embriogenesis adalah bukti. Jika demikian, maka kapan, pada prinsipnya, apakah jalan pembangunan evolusioner kedua akan terwujud? Mungkin, ketika seseorang meninggalkan Cosmos, di mana kondisi lingkungan akan relatif konstan untuk waktu yang cukup lama. Hilangnya jaringan tulang (demineralisasi tulang dalam keadaan tidak berbobot), yang sangat lambat untuk dipugar dan diregenerasi, dapat dianggap sebagai langkah awal menuju proses adaptasi manusia, sebagai spesies, hingga eksistensi dalam kondisi Cosmos. Namun, pembayaran untuk jalan kedua pembangunan evolusioner akan berbeda - kemandulan akan menjadi harga yang harus dibayar kembali ke semua sel totipotency dan plastisitas mutlak. Jadi berkembang biak di dunia "bunglon evolusi" ini tidak akan memiliki meiosis, otpochkovaniem. Tapi kita akan hidup lama. Keabadian Telomerase adalah keabadian amuba. Dalam organisme multiselular, sel induk adalah substrat dari umur panjang kuantitatif dan kualitatif.

[1], [2], [3], [4]

Sumber sel induk embrionik

Sumber hari ini sel induk embrionik untuk tes laboratorium Jalur murine teratokarsinoma (129 / sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) dan teratokarsinoma manusia (NTERA-2, TERA-2 , Kloning H-9), serta garis ESC Trauneone. Namun, kehadiran paspor selular rinci menunjukkan fenotipe kekebalan tubuh, hasil analisis kromosom dari profil ekspresi mRNA terkena reseptor dan protein intraseluler signaling tidak mengimbangi kelemahan yang signifikan teratokartsinomnyh garis ESC - cepat hilangnya totipotency dan kemustahilan aplikasi dalam uji klinis, dan dicampur diferensiasi dalam budaya sangat sulit untuk mengisolasi garis khusus murni dari populasi sel heterogen. Oleh karena itu, biasanya sumber garis ESC diproduksi untuk tujuan klinis, berfungsi sebagai inner cell mass dari blastokista, embrio blastomer individual dari tahap 8-cell pembangunan, sel-sel morula tahap selanjutnya, dan sel benih utama.

Perlu dicatat bahwa sel teratokarsinoma, walaupun mereka memiliki sifat pluripotensi, memiliki potensi pluripoten yang jauh lebih rendah dibandingkan dengan ESC. Integrasi mereka dengan sel embrio jarang mengarah pada pembentukan chimeras, di mana, di samping itu, gamet dengan genotipe sel teratokarsinoma tidak pernah terbentuk. Hal ini diyakini bahwa ini disebabkan oleh kelainan kromosom yang sering terjadi pada penanaman sel teratocarcin: hilangnya kromosom Y, berbagai trisomi, deletasi, atau translokasi.

Upaya untuk membedakan garis ESC manusia telah dilakukan berkali-kali, namun tugas ini tidak dapat dipecahkan, karena blastokista manusia normal sulit untuk mengakses objek. Selain itu, pada manusia, frekuensi kelainan kromosom lebih tinggi daripada embriogenesis hewan. Mayoritas utama embrio manusia purba yang diperoleh setelah fertilisasi in vitro menunjukkan mosaik kromosom kacau dan seringkali terjadi penyimpangan numerik dan struktural. Bahkan kemudian, pada tahap blastokista, hanya 20-25% embrio manusia yang terdiri dari sel dengan kariotipe normal. Hampir tidak mungkin menggunakan embrio semacam itu untuk membuat ESC, karena zigot biasanya dikultur pada tahap dua atau empat blastomere dan kemudian dipindahkan ke dalam rahim. Baru belakangan ini adalah teknik yang andal yang dikembangkan untuk penanaman ovula manusia yang telah dibuahi ke tahap blastokista. Pengenalan teknik ini ke dalam praktik fertilisasi in vitro tidak hanya meningkatkan frekuensi hasil implantasi yang berhasil, namun juga membuat blastokista normal menjadi objek yang lebih mudah diakses.

Sumber sel induk pluripoten lainnya adalah sel kuman primer yang, tidak seperti populasi nenek moyang yang lebih maju dari epitel hermetis, tidak memiliki integrin beta di permukaannya, namun mengekspresikan aktivitas alkalin fosfatase yang tinggi. Perlu dicatat bahwa dalam percobaan, populasi sel punca, yang terbentuk dari sel kelamin primer, telah dipelajari sejak tahun 80an abad yang lalu. Pada saat yang sama, teknik untuk mengisolasi sel kuman primer dari rudimen embrio gonad tikus dikembangkan. Hasil pertama gagal dari budidaya sel kuman primer secara in vitro menyarankan keputusasaan dari usaha ini, karena sel-sel, walaupun mereka bertahan, tidak berkembang biak dan meninggal dalam 24 jam pertama. Kemudian ditemukan bahwa sel kuman primer tikus bereproduksi secara in vitro hanya dengan adanya faktor pertumbuhan polipeptida spesifik larut dan membran pada medium kultur. Hasil dari berbagai penelitian menunjukkan bahwa kelangsungan hidup dan proliferasi sel kuman primer memerlukan adanya dalam media kultur tidak hanya LIF, tetapi juga faktor produksi Steel-factors (SIF) yang terikat membran, dan juga dapat larut. Peptida ini diproduksi oleh sel somatik embrio homozigot untuk mutasi Steel, dan salah satunya adalah ligan kista proto-onkogen.

Sel kuman primer mamalia dan manusia berasal dari ekstrakagonis dan merupakan sumber perkembangan klonal dari garis sel seks. Awal dari garis sel kuman primer, serta semua jaringan embrio, serta mesoderm ekstraembrionik, memberi epiblast (ektoderm primer) pada embrio awal, yang memiliki struktur struktural mosaik. Penghilangan mikrosurgik berbagai bagian embrio awal membentuk zona pelokalan di epiblast dari tiruan prekursor utama sel kuman primer. Dengan bantuan rhodamine dextran, yang digunakan sebagai penanda sel, ditetapkan bahwa prekursor sel seksual primer terletak di daerah epiblast proksimal, di samping ektoderm ekstra embrio. Garis sel seksual primer muncul dari klon sel 45, yang pengalokasiannya terjadi pada permulaan gastrulasi. Kemudian segregasi kloning terjadi, dan selama gastrulasi, sel seks utama memasuki mesoderm ekstraembron dan ditemukan di dasar kuncup allantois, di belakang pita primer. Dari situlah sel-sel kuman utama bermigrasi menuju ujung ventral endoderm endoserviks dan kemudian secara aktif bergerak sepanjang mesenterium, yang mengisi rol genital pada akhir migrasi. Dalam proses migrasi, dan juga dalam 2-3 hari pertama lokalisasi pada rudal gonad, sel seksual utama secara aktif berkembang biak dan menjalani delapan siklus replikatif. Jika pada awal migrasi ada sekitar 50 sel kuman primer, pada kista reproduksi embrio tikus perkembangan 12 hari, jumlah sel seks primer melebihi 25.000.

Kesamaan fungsional antara ESC dan sel seks primer ditunjukkan oleh integrasi lengkap yang terakhir ke dalam blastokista, menggantikan massa sel internal dan perkembangan embrio selanjutnya, jaringan yang hanya terdiri dari keturunan sel kelamin primer. Menurut karakteristik lain murine utama kuman sel PGCs juga identik, yang menunjukkan kemampuan untuk berdiferensiasi menjadi arah yang berbeda, untuk membentuk tubuh embryoid in vitro, in vivo bentuk teratoma saat disuntikkan ke bawah kulit tikus imunodefisiensi menyerupai teratoma spontan tikus testis baris 129 / ter.

Ditemukan bahwa ketika LIF, SIF yang terikat pada membran dan larut ditambahkan ke sel kuman primer terisolasi, embrio tikus berumur 8 hari bertahan dan berkembang biak dalam kultur selama 4 hari, namun kemudian mati. Dan periode ketika kematian sel seksual primer diamati pada kultur bertepatan dengan tahap perkembangan embrio tikus (12,5-13,5 hari), ketika pada dasar gonad sel kelamin primer betina memasuki meiosis, dan pada sel kelamin utama laki-laki mitosis divisi. Namun, jika kita menambahkan lingkungan tidak hanya faktor pertumbuhan LIF dan SIF, tapi juga FGF2, sel seks utama terus berkembang biak, dan di subkultur, koloni sel terbentuk yang dapat bereproduksi bahkan setelah faktor pertumbuhan (SIF dan FGF) dikeluarkan dari medium. Sel semacam itu dapat dikultur untuk waktu yang lama pada substrat fibroblas embrionik tanpa penambahan faktor pertumbuhan LIF yang mudah larut. Garis sel stabil ini berasal dari sel kuman primer yang disarankan disebut sel kuman embrio. Istilah ini tidak dapat dianggap berhasil, karena tidak mungkin menghasilkan sel kuman embrionik saat sel EG dibiakkan, yang dapat melakukan tahap oogenesis atau spermatogenesis berikutnya. Hal ini disebabkan oleh fakta bahwa garis sel EG, meskipun berasal dari sel seks primer, namun memperoleh sifat sel induk pluripoten embrio dalam budaya, kehilangan kemampuan untuk melakukan garis hermetis. Dengan kata lain, sel kelamin primer kehilangan sifat prekursor gamet saat kultivasi dan diubah menjadi sel pluripoten seperti ESC.

Perlu dicatat bahwa ketika tikus dengan status imunodefisien EG diberikan, teratoma tidak muncul. Diasumsikan bahwa hilangnya kemampuan sel EG manusia untuk memulai teratoma adalah karena fakta bahwa garis-garis ini tidak diciptakan secara langsung dari sel kuman primer kultur namun diperoleh dari sel yang diisolasi dari tubuh embrio. Oleh karena itu, mungkin saja mereka adalah keturunan pluripoten, namun sudah melakukan sel.

Perlu dicatat bahwa ada perbedaan mendasar antara sel EG dan sel kuman primer. Yang terakhir ini tidak memungkinkan untuk mendapatkan embrio tikus chimeric, yang mengindikasikan kurangnya kemampuan sel kuman primer untuk berintegrasi ke dalam massa sel internal atau trophectoderm. Karakteristik populasi sel seks primer lebih mirip dengan garis komitmen sel somatik embrio kemudian, pengenalan yang ke dalam blastokista juga tidak mengarah pada pembentukan embrio chimeric.

Modifikasi teknik membiakkan tubuh embrio yang diperoleh agregasi sel EG telah memungkinkan untuk memilih populasi sel pluripoten lain, yang disebut "sel tubuh turunan embrio (sel EBD)", dengan seleksi pada media selektif. Kemampuan sel EBD untuk berkembang biak dalam waktu lama dalam budaya memungkinkan untuk menciptakan garis sel sel yang sel stabil. Klon sel mengekspresikan spektrum yang luas dari mRNA dan penanda protein sel khusus diperoleh. Pendekatan ini terbukti membuktikan bahwa sel kuman utama manusia bersifat pluripoten dan membedakan secara in vitro menjadi berbagai jenis sel: menjadi neuron, neuroglia, endothelium vaskular, sel hematopoietik, sel otot dan endodermal.

Sumber alternatif sel induk embrionik

Sumber alternatif jalur ESC manusia bisa menjadi sel hibrida. Implantasi ke dalam rahim sapi semu geterogenomnoy struktur diperoleh ketika penggabungan melalui elektroporasi fetusa sel somatik manusia dengan sapi telur, yang sebelumnya telah dihapus dari pronukleus itu, memungkinkan untuk menerima inner cell mass dari pra-implantasi embrio tahap perkembangan buatan. Untuk ini, blastokista dari telur sapi dengan inti transplantasi sel manusia diperoleh pada tahap pertama.

Pada tahap kedua, embryoblast diekstraksi dari blastokista, dan darinya - ESC sesuai dengan metode Thomson. Perlu dicatat bahwa hasil terbaik pada isolasi garis ESC menggunakan metode ini diperoleh dengan menggunakan nukleus sel folikel atau sel kuman primer yang bertahan dalam tubuh manusia dalam keadaan hibernasi. Hal ini disebabkan oleh fakta bahwa inti sel manusia yang ditransplantasikan ke dalam sel telur harus memiliki telomere yang tidak disingkat dan aktivitas telomase tinggi, yang menghindari penuaan dini pada klon ESC yang diperoleh dari sel telur hibrida (Repin, 2001). Diketahui bahwa protein penanda intraselular EGF yang paling penting adalah Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, yang termasuk dalam protein peredam chromatin yang disebut. Silencer memberikan kemasan kompak heterochromatin, yang mencegah pembentukan loop dari euchromatin. Paket kromatin yang dimediasi oleh protein ini berkorelasi dengan totipotency genom ESC. Sampai saat ini, telah ditetapkan bahwa kelopak sapi dewasa dan manusia adalah satu-satunya jenis sel khusus yang mengandung protein peredam konsentrasi tinggi di sitoplasma. Atas dasar ini, sebuah metode dikembangkan untuk produksi ESC hibrida dengan mentransfer inti sel somatik ke sel induk non-nuklir sapi. Penelitian in vitro awal telah menunjukkan bahwa sitoplasma sel telur dari sapi mengembalikan totipotensi genom inti somatik sel manusia dalam 12-24 jam kultivasi.

Yang menarik adalah data tentang fitur pengembangan preimplantasi embrio manusia, yang mengindikasikan penggantian sel totipoten kemudian oleh populasi sel pluripoten daripada tikus. Studi tentang transformasi sel menunjukkan bahwa sel-sel dari massa sel internal blastokista manusia, selain ESCs, juga menghasilkan sel trofoblas, yang mengindikasikan potensi totalnya.

Diketahui bahwa pada tahap blastokista ada dua populasi sel yang selektif. Salah satunya adalah lapisan luar blastokista, trofoderm, yang berasal dari sel trofoblas dan komponen plasenta embrio lainnya. Populasi sel kedua dikelompokkan menjadi massa padat, yang menghubungkan permukaan dalam trophectoderm. Populasi sel dari massa sel dalam berasal dari semua jaringan dan kuman organ embrio. Pada tahap blastokista akhir, endoderm ekstra embrional terbentuk dari massa sel internal dan epiblast terbentuk (ektoderm primer). Pada saat yang sama, sel epiblast mempertahankan pluripotency, sementara kemampuan untuk membedakan sel endoderm extra-germinal terbatas.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Memperoleh sel induk embrio manusia

Sampai saat ini, diyakini bahwa tidak mungkin mendapatkan ESC dari trofoblas. Sel induk baris trofektoderm Namun diploid terisolasi dari blastokista di media yang berisi, bukan LIF dan FGF2 heparin, berproliferasi dan berubah menjadi sel induk. Jika Anda menghapus dari tengah-tengah FGF2, sel-sel trofektoderm berhenti berkembang biak, mereka mulai endoreduplikasi kromosom dan elemen seluler trofektodermalnye secara bertahap berubah menjadi sel-sel trofoblast raksasa. Mungkin, LIF tidak merangsang proliferasi sel trophectoderma karena fakta bahwa FGF2 memicu transsignalizatsii mekanisme sebagai FGF2, mengikat reseptor sitoplasma (FGFR2), aktifkan MAP kinase dalam sitoplasma - ERK1 dan ERK2. Akibatnya, ketika dimasukkan ke dalam sel-sel blastokista satu jalur pensinyalan (LIF - gpl30 - JAK-Kinase - STAT3) sel inner cell mass diubah menjadi hESCs berpotensi majemuk, saat mengaktifkan mekanisme kedua transmembran signaling (FGF2 - FGFR2 - MAP kinase ERK1 / ERK2) Pada blastokista, sel induk dari trophectoderm terbentuk. Pilihan jalur pensinyalan, pada gilirannya, bergantung pada aktivitas gen okt4. Gen milik domain POU ini, terletak pada lokus t 17 autosom dan dinyatakan selama oogenesis, di menghancurkan periode serta dalam sel-sel dari massa sel bagian dalam blastokista, dan dalam sel germinal primordial. Peran fungsional gen okt gen terletak pada pengkodean faktor transkripsi yang diperlukan untuk munculnya sel pluripoten, diferensiasi dan dedifferentiasinya.

Ekspresi gen okt gen di ESC bervariasi tergantung pada interaksi faktor transkripsi ini dengan kofaktor. Regulasi terarah dari ekspresi okt4 pada blastokista menunjukkan bahwa ketika aktivitasnya menurun, setengah dari sel membentuk trophectoderm, sedangkan dengan peningkatan ekspresi induksi okt4, sebagian besar ESC terjadi.

Dalam percobaan tersebut, ESC tidak dapat diubah menjadi garis saat mengolah blastomeres totipoten pada tahap penghancuran, begitu juga pada tahap gastrulasi dan tahap perkembangan embrio selanjutnya. ESC tikus biasanya dialokasikan pada hari kehamilan 3,5-4,5, yang sesuai dengan blastokista lapis tunggal keenam (six-layered blastocyst) dan tahap ketujuh (blastokista dua lapis - sebuah silinder telur awal) dari embriogenesis normal. Jelas, hanya pada periode praimplantasi embrio tikus mengandung populasi seluler yang dapat diubah menjadi ESC. Akibatnya, isolasi garis ESC hanya mungkin terjadi pada tahap embriogenesis tertentu. Totitipoten, dari sudut pandang kemungkinan berkembangnya embrio yang layak dengan selaput embrio dan plasenta, adalah zigot dan blastomere yang timbul saat menghancurkan. Hilangnya potensi total sel germinal dimulai pada tahap morula akhir, saat ledakan lebih lanjut terjadi pada lokasi mereka. Blana awal Morula mempertahankan totipotency, karena manipulasi eksperimental dengan perubahan di lokasi mereka, misalnya pembalikan lokasi mereka, tidak mencegah perkembangan embrio utuh.

Ditemukan bahwa efisiensi pelepasan ESC di garis dipengaruhi oleh keadaan blastokista pada saat eksplanasinya. Penggunaan blastokista setelah pemodelan tujuh hari diuuse tujuh hari di saluran genital tikus yang diindikasikan pada hari ke 3,5 kehamilan dan menerima progesteron meningkatkan alokasi sel induk sel embrionik yang lebih berhasil. Diasumsikan bahwa dalam kondisi seperti itu jumlah blastomer yang membentuk massa sel dalam meningkat. Ada kemungkinan juga bahwa siklus sel meluas dan kebanyakan blastomere memasuki fase G0.

Selain itu, pembentukan garis ECG pluripoten yang stabil bergantung pada genotipe embrio: ESK mudah diisolasi dari blastokista garis murine 129, jauh lebih sulit untuk mendapatkannya saat menggunakan tikus CS7BL / 6 dan secara praktis tidak mungkin untuk mengisolasi jalur ESC dari blastokista tikus CBA / Ca. Jelas, embrio awal memiliki beberapa ciri genetik yang mempengaruhi perkembangan garis ESC pluripoten. Namun demikian, dalam budidaya epibl terisolasi, dan juga dengan selektif pemilihan sel yang berbeda, garis ESC dari embrio awal tikus CBA / Ca masih terisolasi.

Teknik standar yang telah terbukti untuk mendapatkan jalur ESK dari blastokista diberikan dalam manual laboratorium mengenai teknik percobaan dengan embrio awal. Garis ESK eksperimental juga dapat diperoleh dengan membiakkan epiblast terisolasi (primary ectoderm) dari embrio tikus 4,5 hari dengan teknik mikrosurgis yang agak kompleks dan kondisi budidaya yang dimodifikasi. Kompleksitas prosedur ini dibenarkan, karena frekuensi pembentukan garis ESC jauh lebih tinggi daripada bekerja dengan massa sel internal blastokista.

Untuk mengisolasi jalur ESC, masing-masing kloning dipindahkan ke mikro-sumur, agregat sel 40-60 ditanam, kemudian dipecah lagi. Beberapa pengulangan prosedur ini memungkinkan untuk mendapatkan garis ESC yang diabadikan dengan tingkat proliferasi sel normocaryotic yang terlampir pada plastik, yang melalui 50-100 bagian, mempertahankan totipotency dan aktivitas telomerase tinggi. Dalam proses mendukung garis ESC, pencemaran lingkungan atau serum dengan endotoksin bakteri adalah konsentrasi endotoksin yang paling berbahaya - bahkan trace dalam medium kultur menyebabkan kematian sel germinal yang belum matang. Dengan pemantauan pertumbuhan linier dan penyebaran tepat waktu secara hati-hati, ESC dalam kultur mampu melakukan pemisahan simetris, di mana kedua sel anak tetap pluripoten dan mampu melakukan siklus sel dalam jumlah tidak terbatas sembari mempertahankan kariotipe diploid dan potensi total.

Pemilihan populasi ESC manusia yang bersih dapat dilakukan setelah transfeksi ke dalam genom molekul DNA rekombinan yang mengandung gen yang mengkodekan sintesis protein fluoresen hijau (GFP). Ekspresi GFP meningkat dengan pertumbuhan ESC dalam kondisi yang mendukung proliferasi mereka, sedangkan dengan onset diferensiasi, tingkat ekspresi gen ini berkurang, yang memungkinkan pemilihan garis sel pluripoten stabil murni pada media selektif. Ketika diolah dengan seleksi GFP dari ESCs, frekuensi koloni sangat meningkat, karena pada kondisi pemilihan tanaman efek antiproliferatif yang kuat dari sel yang berbeda dapat dieliminasi.

Pengalihan sel induk embrionik manusia ke dalam jalur dilakukan dengan metode isolasi mereka dari embrio preimplantasi (pada tahap 80-120 sel), yang tetap ada setelah prosedur fertilisasi in vitro. Untuk ini, embrio "kelebihan" yang diperoleh secara artifisial terdispersi secara mekanis di lingkungan Delbecco-Needle. Setelah sel diberi label dengan antibodi monoklonal selektif dengan label neon, sel-sel embrioblas diisolasi. Embrioblast didispersikan ke dalam sel individu dengan menggunakan campuran disaspase-collagenase. Sel yang terdisosiasi tumbuh dalam media khusus (80% serum susu Delbecco + 20% serum janin di hadapan 500 μg / ml IL-6, LIF dan SCF) melalui monolayer umpan dari fibroblas embrio dari 3 bagian pertama. Dalam kasus ini, kelangsungan hidup dan proliferasi sel induk dan progenitor didukung oleh paparan IL-6, LIF dan SCF. Di lingkungan seperti itu, ESC tumbuh oleh klon suspensi sel tergores yang tidak terikat, yang harus dipisahkan dengan perpipaan pipih yang lembut. Klon baru muncul dalam budaya yang ditangguhkan pada hari ke-7. Tingkat pertumbuhan maksimum ESC dicapai dengan disosiasi ulang klon pada tahap 10-15 sel. Kemudian, masing-masing kloning dipindahkan ke microcell dan tumbuh menjadi agregat 40-50 sel. Prosedur diulang berkali-kali di bagian-bagian, meningkatkan volume kultur hingga kepadatan 5-10 juta sel per cangkir 6 sentimeter. Dengan menggunakan seperti Thomson passaging itu diisolasi 10 klon ESCs manusia abadi yang melalui saluran 100 mempertahankan aktivitas telomerase yang tinggi, kemampuan untuk proliferasi intens dan karakteristik fenotipik total potensi minimum, dengan diferensiasi dalam salah satu 350 baris sel khusus yang berasal ecto-, meso - dan endoderm Diferensiasi ESC manusia dimulai (dengan perubahan lingkungan, penambahan serum dan eliminasi LIF) dari pelekatan sel ke substrat, yang mengindikasikan perkembangan sitoskeleton dan ekspresi reseptor adhesi. Penting bahwa dengan proliferasi ESC manusia yang tidak terbatas, kariotipe normal dipertahankan.

Metode kedua untuk mengisolasi jalur ESC manusia didasarkan pada penggunaan sel seks primer. Penelitian eksperimental telah menunjukkan bahwa garis sel Eu dapat diperoleh dari plakat genital embrio tikus 12,5 hari. Namun, dalam kasus ini, frekuensi pembentukan garis sel progenitor secara signifikan lebih rendah daripada percobaan dengan embrio sebelumnya. Pada saat yang sama, sel seks primer dari gonad embrio tikus usia gestasional 13,5 hari pada umumnya tidak mampu berubah menjadi garis.

Garis stabil pertama dari sel EG manusia pluripoten diperoleh dari gonosit primer yang diisolasi dari tunas genital dari embrio berumur 5-9 minggu. Sel terisolasi dikultur pada substrat fibroblas embrio tikus yang tidak aktif dalam medium DMEM dengan serum janin dimana meraptoethanol, forskolin, dan juga faktor pertumbuhan manusia rekombinan (FGF dan LIF) ditambahkan. Setelah 7-12 hari, koloni multisel muncul dalam budaya, sesuai dengan ciri morfologi dan penanda molekuler yang sesuai dengan sel EG manusia. Setelah agregasi, sel-sel ini membentuk tubuh embrio, dengan perkembangan selanjutnya sel-sel khusus muncul, karakteristik untuk turunan dari ketiga daun embrionik tersebut. Sepanjang 10-20 bagian garis sel EG mempertahankan kariotipe normal dan tidak kehilangan pluripotency.

Hal ini juga menunjukkan bahwa efek kombinasi faktor produksi LIF, membrane-bound dan soluble Steel, serta TGF-b, memodifikasi program pengembangan sel kuman primer. Alih-alih menghentikan perpecahan mitosis dan mulai berdiferensiasi dengan oogenesis atau spermatogenesis, sel seks primer terus berkembang biak. Setelah beberapa siklus mitosis tambahan, mereka menjadi serupa dengan sel epiblast dan, kehilangan sifat prekursor sel kuman, diubah menjadi sel induk embrion embrionik pluripoten.

Jadi, pada tahun 1998, garis sel seksual primer yang diabadikan pertama kali diisolasi dari rudimen seksual jaringan otopsi janin manusia. Pada embriogenesis manusia, sel seks primer muncul di kantong kuning telur pada minggu ke 3 perkembangannya, dan pada usia 4-5 minggu mereka bermigrasi ke zona tuberkulum seksual, di mana populasi dorman bentuk gonosit primer terbentuk. Dalam keadaan tidak aktif, sel kuman primer tetap bertahan hingga lahir. Garis sel kuman primer diisolasi dari tuberkulum genital janin 5-9 minggu, jaringan yang diekstraksi ex tempore diobati dengan campuran kolagenase tipe IV-V, hyaluronidase dan DNase untuk meningkatkan hasil sel kuantitatif dan kualitatif. Sel kuman primer di jaringan tuberkulum genital janin dikelilingi oleh sel stik (stamping) Sertoli. Tujuan fungsional sel Sertoli adalah produksi faktor anti apoptosis (Fas-ligand), mitogens, serta imunosupresor yang melindungi sel induk seks dari serangan kekebalan tubuh. Selain itu, lingkungan mikro stroma dari tuberkulum genital berperan penting dalam pematangan gamet. Sel kuman primer terisolasi ditanam dalam kultur melalui lapisan stromal pengumpan yang terdiri dari fibroblas janin dari tiga bagian pertama. Kombinasi paling efektif dari mitogens adalah kompleks yang terdiri dari LIF, FGF dan forskolin (stimulan untuk pembentukan cAMP). Proliferasi sel kuman primer secara in vitro memerlukan penambahan serum janin, dimana adanya proliferasi gonosit primer dalam kultur disertai dengan pembentukan klon sel globular, tidak terikat pada substrat.

Di Institut Nasional Kesehatan Amerika Serikat, berdasarkan generalisasi informasi yang ada mengenai metode pengisolasian jalur ESC manusia dari blastokista, sebuah kesimpulan awal dibuat bahwa keberhasilan pelepasan ESC kemungkinan besar dilakukan dalam pembinaan blastokista dengan massa sel internal yang terbentuk dengan baik (sel induk: kemajuan ilmiah dan arah penelitian masa depan Nat Inst, dari Health USA). Dari sudut pandang ini, sumber optimal ESC untuk pembuatan garis adalah blastokista pada hari ke 5 perkembangan, dimana, ketika mengisolasi massa sel dalam, trophectoderm harus dihapus dengan hati-hati. Massa sel internal yang terisolasi, yang terdiri dari 30-35 sel pada tahap ini, harus dikultur pada substrat fibroblas murine embrio, yang merupakan kondisi menentukan pembentukan koloni ESC dalam kultur.

Analisis fitur fenotipik sel induk embrionik

Yang menarik adalah analisis komparatif interspesifik tentang fitur fenotipik ESC. Ditemukan bahwa ESC koloni manusia - sebuah kelompok padat rata epitel-sel, sedangkan tikus embryoid betis terdiri dari konglomerat longgar sel bulat. Dalam ESC manusia, indeks rasio nuklir-plasma lebih rendah daripada pada tikus ESK. Sel induk monyet embrio membentuk koloni sel yang lebih datar dengan tepi yang tidak rata. Pada klon awal primata ESC, sel tunggal mudah terlihat. ESC yang berkembang biak dari semua spesies hewan yang diteliti tidak mengekspresikan molekul MHC pada kelas pertama dan kedua. Pada saat bersamaan, ESCs manusia merespon positif terhadap antibodi TERA 1-60 dan GCTM-2, yang mengindikasikan adanya karakteristik proteoglikan keratin / chondroitin sulfate untuk sel induk embrio (terato-karsinoma) di permukaannya. Ekspresi di ESC dari semua spesies hewan dari gen okt4 menunjukkan bahwa meskipun ada perbedaan fenotipik, gen gen yang sama yang bertanggung jawab atas pelestarian pluripotency tampaknya diaktifkan pada ESO manusia dan tikus (Peru, 2001). Selain itu, garis ESC berasal dari tikus embrio, babi, kelinci, primata, dan ternak, memiliki karakteristik morfologi yang sama, satu set sama identifikasi molekul spidol dan mekanisme molekuler hampir identik untuk pelaksanaan program embriogenesis yang memungkinkan Anda untuk mengambil segar melihat masalah xenotransplantation .

Tidak seperti embriogenesis normal in vivo, proliferasi ESC in vitro tidak disertai dengan pembentukan lembaran embrio dan berlanjut dengan latar belakang pemblokiran Nogens homeotik, yaitu tanpa organogenesis. Karena gen segmentasi tidak berfungsi, perkembangan embrio, seperti penyisipan embrio, segmentasi embrio, pembentukan kantung kuning telur, allantoic dan organ dan jaringan sementara lainnya, tidak dapat diproduksi ulang dalam budaya ESC. ESC budaya dibekukan pada awal pembentukan 350 garis pembatasan sel khusus. Dengan demikian, tiruan sel induk progenitor dan ESC lokal terpusat hanyalah model embrio, dalam perjalanan pengembangan berbagai jalur sel khusus, yang bagaimanapun berasal dari prekursor umum, bersamaan terbentuk di daerah jaringan yang berbeda. Meskipun tingkat reseptor minimal pada permukaan ESC, mereka mempertahankan kemampuan untuk melakukan proses formatif primitif, meniru struktur tebal embrio awal: penghentian ESCO dalam agregat agregat dan membentuk struktur yang menyerupai blastokista atau bahkan embrio lain (silinder telur). Agregasi suspensi seperti itu diberi nama badan embrio yang sederhana dan kompleks.

Ketika dicampur berdiferensiasi menjadi berbagai sel tubuh embryoid secara bersamaan diungkapkan oleh awal gen ektoderm (oct3, FGF-5, nodal), endoderm (gata-4), mesoderm (brachyury), kardiogenik mesoderm (PKH-2,5), tabung saraf (msx3 ) dan hematopoiesis (elkf). Dengan bantuan berbagai kombinasi faktor pertumbuhan dan sitokin, dalam beberapa kasus dimungkinkan untuk mendapatkan tubuh embrio di mana gen ektoderm atau mesoderm lebih disukai diekspresikan, yang membuka jalan untuk memodelkan gastrulasi dan tahap awal organogenesis.

Pertumbuhan Clonal ESC adalah bukti pembelahan sel asimetris, di mana hanya satu dari ESC di pusat kloning yang mempertahankan potensi reproduksi tak terbatas, sementara sel perempuan kedua menghasilkan sel progenitor generasi yang sudah dalam diferensiasi. Oleh karena itu, laju perkalian klon di pinggiran bodi embrio lebih tinggi daripada di pusat. Sel marjinal dari kloning tumbuh mengalami diferensiasi acak yang tidak teratur, bermigrasi atau mati oleh mekanisme apoptosis. Peristiwa ini menentukan takdir kloning: jika tingkat proliferasi melebihi tingkat migrasi dan kematian sel apoptosis, ukuran klon terus meningkat, stabilisasi terjadi ketika tingkat apoptosis dan laju pembentukan sel baru sama, regresi dengan hubungan terbalik dari proses ini. Sel progenitor terbagi secara simetris, yaitu kedua sel perempuan terdiferensiasi lebih jauh menjadi garis sel khusus matang. Rasio sel ESC / progenitor bervariasi, tapi selalu jumlah ESC hanya sebagian kecil dari persen populasi sel progenitor. Oleh karena itu, hanya hati-hati pipetting dan tepat waktu disagregasi klon dapat meningkatkan jumlah ESCs dalam budaya. Untuk mendapatkan hasil maksimal ESC, yang paling efektif adalah disagregasi klon pada tahap 10-12 sel. Arah dan derajat diferensiasi sel dalam tubuh embrio tergantung pada lokasinya. Sel-sel eksternal dari tubuh embrio tidak mengekspresikan gen okt gen dan dibedakan menjadi sel-sel endoderm primer, dari mana sel mirip epitel-epitel dari endoderm ekstra parietal dan viseral ekstraeral selanjutnya terbentuk. Sel internal tubuh embrio mengekspresikan gen okt4 dan mempertahankan pluripotensi selama 48 jam kultur. Namun, kemudian penataan ulang morfologi dari budaya terjadi dalam monolayer epitel dan ekspresi gen yang mengendalikan perkembangan ektoderm primer dimulai. Kemudian dimulai proses sitodifferentiasi total yang tidak teratur dengan munculnya berbagai jenis sel yang merupakan turunan dari ketiga lembar germinal tersebut. Dalam proses diferensiasi sel sel embrio secara spontan, agregat dengan penanda endoderm berupa fragmen (kista) kantung kuning telur pertama kali muncul. Selanjutnya, angioblasts dan sel endotel kapiler tumbuh muncul dalam struktur ini. Pada tahap akhir diferensiasi spontan dari sel internal tubuh embrio, berbagai sel yang berbeda membedakan terminal, termasuk neuron, elemen glial, kardiomiosit, makrofag dan eritrosit. Dalam pendekatan tertentu (dengan mempertimbangkan inversi spasial pembentukan lembaran jaringan kuman), badan embrio dapat secara in vitro mempelajari proses morfogenetik dan menganalisis mekanisme molekuler pada periode awal sitode imunisasi, dan juga menetapkan peran gen spesifik dalam merealisasikan proses ini.

Dengan demikian, di dalam kloning adalah sel-sel di mana berbagai program pengembangan genetika ditemukan - ESCs, nenek moyang awal dan populasi leluhur yang berbeda. Kultivasi ESC dengan metode tetesan atau kultur massa yang melorot tanpa lapisan pengumpan dan tanpa penambahan LIF dalam medium pasti mengarah pada pembentukan tubuh embrio. Morfologi sel-sel lapisan luar dan dalam dari tubuh embrio berbeda. Lapisan luar terdiri dari sel proses besar. Permukaan mereka, menghadap ke lingkungan, ditutupi oleh banyak mikrovili. Lapisan luar sel dipisahkan dari membran dasar internal yang menyerupai membran Reichert, sedangkan sel-sel lapisan dalam dari bodi embrio adalah epitel silinder. Secara morfologis, lapisan dalam, meski mengandung banyak sel pemisah, lebih mengingatkan pada koloni ESC yang tidak berdiferensiasi.

Fitur sel induk embrionik manusia

Tidak adanya interaksi sinyal parenkim mesenchymal dengan latar belakang pemblokiran homeostasis menyebabkan pertumbuhan ESC yang tidak teratur dalam budaya, karena penandaan dan pembentukan infrastruktur organ sementara terganggu. Pertumbuhan terorganisir dan diferensiasi spontan teratur dari hESCs dalam budaya karena kurangnya mesenchymal menandai kerangka stroma badan di masa depan: in vitro adalah mungkin pembentukan jutaan hepatosit, tetapi Anda tidak bisa mendapatkan segmen hati, termasuk elemen struktural dan fungsional seperti, seperti sinus, ruang sel Disse dan Kupffer.

Dipercaya bahwa pluripotency ESC diwujudkan secara eksklusif dalam embriogenesis dengan pembentukan jaringan dan organ embrio, sedangkan plasenta dan tali pusar berasal dari trofoblas. Tertutup di shell trofektodermalnuyu ESK secara konsisten menghasilkan klon sel yg dilaksanakan dgn bersyarat mewujudkan program pembangunan oleh mRNA kombinasi curah Nohteyaov topografi matriks, yang mentakdirkan penataan ruang, bentuk, dimensi, jumlah sel organ sementara dan definitif dan perakitan parenkim di unit struktural dan fungsional. Pada saat yang sama, ESCs tetap merupakan satu-satunya jenis sel di mana mekanisme molekuler untuk merealisasikan potensinya benar-benar terputus dari program pengembangan genetika, dan ESC sendiri tidak dapat berinteraksi dengan sel lain karena pemblokiran persepsi reseptor dan sistem trans-sinyal. Namun, cukup ESCs aktivasi hasil bertahap penyebaran embriogenesis Program ending lahir benar-benar terbentuk dan siap untuk kehidupan ekstrauterin dari suatu organisme yang terdiri dari milyaran sel. Dalam waktu singkat ini, tetapi utang yang tak terbayangkan di ruang jalur kejadian yang tak terelakkan seluler kesalahan dalam mekanisme molekuler yang menyediakan fungsi-fungsi vital sel, dan dalam program yang mengontrol proliferasi mereka, diferensiasi dan spesialisasi. Oleh karena itu, dalam farmakogenomik modern, kita secara terpisah mempertimbangkan penyakit struktur molekul dan penyakit pemrograman sel. Dan efek dari kebanyakan obat baru ditujukan untuk memperbaiki program diferensiasi, proliferasi dan organogenesis, serta regenerasi organ dan jaringan. Dalam organisme dewasa melalui ESCs menjadi mungkin untuk mengontrol perilaku sel-sel induk / progenitor ditransplantasikan ke dalam otak, hati, limpa, sumsum tulang dan organ lain dari manusia untuk memperbaiki penerima rusak organ parenkim akibat diferensiasi dan spesialisasi sel mesenchymal donor diawetkan matriks. Intinya, program totipotency mulai menyadari pada tingkat genom oosit, zigot dan blastomer, namun sel-sel ini belum bisa dikloning dan dipaparkan dalam jumlah yang diperlukan untuk kebutuhan pengobatan eksperimental dan praktis. Oleh karena itu, ESC tetap merupakan sumber informasi genetik unik yang berisi kode untuk peta embrio tiga dimensi dan kode pembatasan linier untuk jalur sel khusus selama gastrulasi.

Kemampuan regeneratif ESC yang hampir tak terbatas adalah karena genom mereka, tidak seperti alat genetik sel somatik yang terdiferensiasi, mempertahankan pluripotency. Salah satu manifestasi dari keadaan tidak aktif berakar pada ESCs informasi genetik yang disebut fenotipe minimum - pada permukaan ESC mengungkapkan sejumlah reseptor, dan karena itu dikerahkan sangat sedikit program untuk berinteraksi aparat nuklir transsignalizatsii dari sel dengan lingkungan mikro nya. Dengan latar belakang hibernasi gen yang bertanggung jawab atas pembatasan garis sel khusus dan diferensiasi sel, hanya sekitar 30 dari 500 gen yang diaktifkan, produk yang memastikan hubungan sel dengan lingkungan mikro di sekitarnya. Menggunakan metode analisis serial ekspresi gen menunjukkan bahwa sifat umum dari kotak genom fungsional utama yang mengatur energi dan metabolisme dalam sel somatik dan ESCs di terakhir ditentukan jumlah yang sangat rendah mRNA reseptor, G-protein, utusan kedua, transcriptases, kofaktor berekspresi dan represi , yaitu seluruh sistem transmisi transmembran dari sinyal regulasi ke dalam sel. Hal ini disebabkan oleh kurangnya atau sangat rendahnya ekspresi gen transsanalization. Selama diferensiasi diinduksi dalam genom dari ESC 18 operasi berhenti serentak berfungsi gen untuk latar belakang aktivasi transsignalizatsii 61 gen mengendalikan sintesis reseptor adhesi sel, komponen matriks ekstraseluler, pembatasan transcriptases elemen messendzhernyh dan sistem transmisi sinyal untuk unit nuklir dengan reseptor membran sel plasma. Pada saat yang sama, ekspresi gen yang bertanggung jawab untuk sintesis protein peredam, serta penghambat koaksi gen, yang memastikan totipotency genom ESC, diblokir.

Penanda genetik ditemukan untuk sel dari ketiga selebaran embrio. Identifikasi lapisan sel ektodermal dilakukan dengan ekspresi gen nodal, okt3 dan fgf-5, sel mesoderm - brachyury, zeta-globin, endoderm - dengan ekspresi gen gata-4. Dalam embriogenesis normal, selama gastrulasi mengamati migrasi aktif populasi yang belum matang dari sel induk dan progenitor, lokal menunjuk daerah tulang wajah tengkorak, beberapa bagian otak, sistem saraf perifer, sistem konduksi jantung dan jaringan timus yang terbentuk dari klon pengungsi sel. Penandaan sel pada gen awal lembaran embrio memudahkan tugas analisis topografi proses migrasi sel progenitor pada embrio yang sedang berkembang. Hal ini ditemukan pada khususnya bahwa sel-sel di agregat embryocarcinoma P19 ekspresi dari brachyury gen mesoderm pertama dimulai pada pengurangan ekspresi gen dari aktivator plasminogen jaringan, a-fetoprotein, keratin 8, dan keratin 19, yang merupakan penanda dari mesoderm awal populasi migran. Akibatnya, pembentukan jaringan asal mesodermal dimulai hanya setelah selesainya proses migrasi titik dan migrasi sel progenitor mesodermal.

Dengan tanda fenotipik yang sangat terbatas dan tidak adanya unit trans-signaling yang paling banyak, ESC masih mengekspresikan beberapa molekul reseptor yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi mereka. Perlu dicatat bahwa antigen-penanda ESC pada manusia dan primata ternyata umum terjadi. Paling sering digunakan untuk hESCs label label antibodi terhadap antigen membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (antigen lipid yang unik yang mewakili GL7 glycolipid kompleks dengan asam sialic), serta glikoprotein polimer tinggi TRA-1-81, TRA-1-60. Sebagai tambahan, ESCs mengekspresikan embrio spesifik antigen SSEA-1 dan endogenous alkaline phosphatase, serta faktor transkripsi Oct4 tertentu. Yang terakhir ini diperlukan untuk mempertahankan mekanisme proliferasi ESC - faktor transkripsi spesifik Oct4 mengaktifkan ekspresi gen faktor pertumbuhan fibroblas 4 dan menstabilkan ekspresi kotak gen yang bertanggung jawab untuk reduplikasi DNA tak terbatas pada sel yang belum matang. Protein penanda intraselular yang paling penting adalah Oct3, Oct4, Tcf, dan Groucho, yang terkait dengan protein peredam kromatin.

Hampir segera setelah jangka panjang berbudaya ESCs upaya tidak berhasil dan organisme pertama kali disusun oleh budaya sel induk terisolasi dari blastokista mouse, dan kultur sel germinal primer, mulai studi kapasitas ESC pluripotency tahap bila diberikan pada tahap awal perkembangan embrio. Telah ditunjukkan bahwa pada tahap morula dan blastokista, ESC mampu membentuk embrio chimeric di mana keturunan ESC donor terdeteksi di semua jaringan somatik dan bahkan di gamet. Dengan demikian, sebuah "jembatan" antara studi eksperimental in vivo dan in vitro didirikan dalam biologi perkembangan dengan bantuan ESCs, yang sangat memperluas kemungkinan untuk mempelajari proses peletakan jaringan primer dan organ, diferensiasi dan organogenesis embrionik mereka.

Jelas bahwa in vivo dalam proses embriogenesis, ESCs diintegrasikan ke dalam massa sel kuman awal, dan turunannya ditemukan di semua organ dan jaringan. ESCs berkoloni dalam embrio chimeric garis sel seks, keturunannya membentuk ovula penuh dan spermatozoa. Sel induk embrio adalah klonogenik - satu ESC tunggal mampu menciptakan koloni sel genetik yang identik dengan penanda molekuler, yang mencakup ekspresi gen oct4 dan alkaline phosphatase, aktivitas telomerase tinggi, dan ekspresi antigen embrio tertentu.

Untuk mempelajari mekanisme embriogenesis dengan bantuan ESC, metode chimerisasi morula dikembangkan dengan menciptakan struktur biologis, di luarnya lapisan blastomeres tetraploid penerima berada, dan ESC donor dimasukkan ke dalamnya. Dengan demikian, trofoblas terbentuk dari keturunan tetraploid blastomer penerima yang memungkinkan implantasi dan plasentasi, dan PGCs donor bertindak sebagai inner cell mass, yang terbentuk dari garis kuman yang layak dari primer tubuh dan nenek moyang gamet. Nilai penelitian ESC tidak hanya ketika memanipulasi in vitro dengan genomnya, pluripotency tetap terjaga, namun juga kemampuan ESC untuk berpartisipasi dalam pembentukan sel seks primer janin chimeric dipertahankan. Hal ini menunjukkan bahwa keturunan hanya satu ESC yang dimodifikasi secara genetis memproduksikan semua dasar primer dan jaringan yang muncul dari embrio chimeric yang diperoleh dengan agregasi atau ko-kultivasi sel ini dengan embrio 8 sel. Ketika ditransplantasikan ke dalam morula tikus ESC yang transfected dengan gen protein fluoresen hijau, keturunan fluoresen sel ini ditemukan di semua jaringan uji embrio yang sedang berkembang (Shimada, 1999). Transplantasi ESC ke dalam morula memungkinkan terciptanya tikus yang layak, yang tubuhnya hanya terdiri dari keturunan ESC donor, yang membuka prospek berbagai pilihan untuk kloning terapeutik. Sekarang pendekatan metodologis ini berhasil digunakan untuk mempelajari masalah biologi perkembangan, khususnya, menganalisis mekanisme inaktivasi genetik kromosom X atau ketidakstabilan epigenetik ESC. Transplantasi ESC ke embrio awal juga digunakan dalam bioteknologi di bidang pertanian, dan juga dalam percobaan terapi gen.

Transplantasi ESC yang dimodifikasi secara genetik digunakan untuk menguji sel target gen mutan. ESCs yang diobati secara in vitro digunakan dalam bioteknologi untuk menciptakan tikus knockout. Untuk melakukan ini, dengan rekombinasi homolog, gen yang akan diperiksa dikeluarkan dari ESC, dan sel yang kekurangan gen ini diisolasi pada media selektif. Kemudian KO ESCs disuntikkan ke blastokista atau digabungkan dengan blastomeres morula. Embrio awal chimeric sehingga ditransplantasikan ke penerima wanita, dan pada tikus yang baru lahir, individu dengan gamet, nuiltzigotous untuk gen tersebut, dipilih. Dengan teknologi ini, banyak lini tikus knockout telah diciptakan, yang banyak digunakan dalam biologi eksperimental dan pengobatan eksperimental. Pada model biologis seperti itu, pentingnya gen tertentu dalam perkembangan embrio dipelajari, serta perannya dalam mekanisme penyakit dan kondisi patologis manusia. Selain itu, garis binatang knockout digunakan dalam tahap pengujian praklinis metode baru terapi gen. Sebagai contoh, dengan transfeksi ke dalam genom ESC dari alel normal gen mutan, adalah mungkin untuk secara efektif mengoreksi mutasi yang merusak sistem hematopoiesis. Pengenalan gen alien ke ESC memungkinkan pembuatan garis hewan laboratorium transgenik homozigot pada tingkat yang dipercepat. Namun, perlu dicatat bahwa teknik penghilangan rekombinasi gen yang diarahkan telah berhasil dilakukan untuk saat ini hanya terhadap ESC tikus. Menggunakan ESCs murine sistem gugur ganda dipasang daerah klaster fungsional peran gen pada kromosom 7 (copy wilayah genomik kromosom 19 menit manusia), dan bagian proksimal dari kromosom 11 (copy kromosom 5d manusia) - penghapusan gen ini di Tikus ESK diizinkan untuk mengevaluasi fungsi analog mereka pada manusia.

Studi Fungsi kapasitas gen embrio manusia, transfeksi gen yang hewan laboratorium diperbolehkan hESCs di kripto khususnya memperjelas peran gen dalam tab dan membentuk kardiogenik mesoderm, pax-6 gen - di mata embriogenesis. Peta pertama ekspresi gen pada teratokarsinoma ESK yang belum matang berkembang biak dan blastokista tikus dibuat, represi penekan pada gen ESC transsignalization dikonfirmasi. Kombinasi ESCs mutan 60-80 dan 20-30 sel-sel normal pra-implantasi embrio tikus mengarah pada perkembangan embrio chimeric di mana penanda tubuh terdiri dari sel-sel donor dan penerima, yang memungkinkan kita untuk menentukan peran gen yang tidak diketahui di gastrulasi dan organogenesis. Peta fungsional gen mengembangkan embrio tikus rincian diperbesar dari peran gen sf-1 tab di kelenjar adrenal dan primordia genital, wt-1 gen - di ginjal tab myoD gen keluarga - di tab dari keluarga gen otot rangka gata-1-4 - dalam pematangan pembatasan dasar eritro- dan limfopoiesis.

Disutradarai off alel ibu dan ayah dari gen dalam hESCs menggunakan vektor rekombinase disajikan untuk memperjelas fungsi berbagai gen selama embriogenesis awal dan teknologi penargetan gen yang tidak diketahui manusia dalam ESCs tikus berkontribusi pada penemuan gen mutan baru yang bertanggung jawab untuk pengembangan penyakit keturunan yang parah. Metode sistem gugur menggunakan didefinisikan signifikansi obligat dari beberapa gen untuk meletakkan jaringan embrio: gata-4 - untuk infark, gata-1 - untuk eritroid jaringan hemopoietic, myoD - otot rangka, brachyury - untuk pembatasan mesoderm transcriptases hnf3 dan hnf4 - untuk sel punca hati, kain lap 2 - untuk peletakan klon limfosit T dan B (Repin, 2001). Penghapusan ganda gen dalam hESCs telah membuka akses untuk mempelajari peran fungsional gen dari lapisan germinal, segmentasi dan homeosis dan transplantasi ESC diberikan kemungkinan memperoleh layak embrio hibrida antarspesies. Dengan menggunakan teknik perbaikan transplantasi ESC donor tunggal ke dalam embrio 8 sel, fakta chimerisasi pada tingkat sel banyak organ penerima embrio telah terbukti. Perhatikan bahwa kuman sel jaringan manusia ditemukan di organ tikus penerima dan setelah diperkenalkannya sel induk hematopoietik manusia ke dalam blastokista. Ditetapkan bahwa ESC pluripoten beredar pada embrio murine selama periode pembentukan organ dalam darah. Ada kemungkinan fungsi biologis mereka ada dalam organisasi embrio dari sistem kekebalan masa depan. Dengan ESC in vitro direproduksi model yang memadai penyakit genetik manusia: model knockout gen distrofin ganda pada tikus Duchenne distrofi otot, gen mematikan atm (sinyal kontrol sintesis kinase kromatin) - ataksia-teleangektaziyu. Dalam hal ini, suatu penyakit keturunan yang fatal pada anak-anak karena cacat dalam perbaikan DNA mengembangkan degenerasi sel-sel Purkinje di otak kecil, yang disertai dengan involusi timus karena kematian sel-sel berkembang biak. Klinik, patofisiologi dan patomorfologi ataksia-telangiektasia, yang direproduksi dengan diperkenalkannya informasi genetik patologis di ESC, pada tikus chimera sesuai dengan yang ada pada manusia. Selanjutnya ataksia-teleangektazii menggunakan PGCs dan tikus knockout mengembangkan model eksperimental, beberapa keturunan penyakit manusia homozigot terkait dengan gangguan metabolisme karbohidrat dan lipid, katabolisme asam amino, penghapusan tembaga dan bilirubin, yang secara signifikan meningkatkan kemungkinan obat eksperimental untuk uji praklinis metode baru untuk mengobati penyakit yang relevan hak.

[12], [13], [14], [15]

Penggunaan sel induk cytohybrid

Sel hibrida yang diperoleh dengan peleburan ESCs dengan sel somatik adalah model yang memadai dan menjanjikan untuk mempelajari pluripotency sel punca dan memprogram ulang kromosom sel yang berbeda. Tsitogibridy diperoleh oleh penggabungan ESC dengan sel dibedakan dari hewan dewasa, memberikan kesempatan untuk mempelajari hubungan antara genom "usia" yang berbeda: mengembangkan situasi yang unik di mana kromosom homolog berasal dari sel-sel dari berbagai tahap diferensiasi, dan berbagai tingkat kematangan, berada di inti yang sama, di mana mereka dapat dengan mudah untuk menukar sinyal regulasi transien. Sulit untuk memprediksi bagaimana sistem epigenetik kisegulasi dari kromosom homolog yang telah dikembangkan selama perjalanan in vivo. Pada sel hibrida, segregasi kromosom parental terjadi, yang memungkinkan untuk mempelajari interaksi genom pada tingkat kromosom individual, yang berpotensi mengidentifikasi keterlibatan kromosom spesifik dalam mempertahankan pluripotency atau, Sebaliknya, sebuah output dalam diferensiasi.

Sebagai model eksperimental pertama untuk mempelajari interaksi genom dengan berbagai "sejarah perkembangan", sitohybrida yang diperoleh dengan peleburan teratokarsinoma pluripoten dan sel somatik terdiferensiasi digunakan. Dalam beberapa kasus, sel hibrida tersebut mempertahankan sifat pluripoten pada tingkat yang cukup tinggi. Secara khusus, sel hibrid teratokarsinoma in vivo menginduksi pengembangan teratoma sejati yang mengandung turunan dari ketiga lembaran germinal, dan pada bodi embrio in vitro dibentuk pada kultur suspensi. Bahkan dalam sitohybrida interspesifik dari jenis ini, antigen embrio dicatat pada kasus dimana pasangan somatik dalam fusi dengan sel teratokarsinoma memiliki limfosit atau timus. Perlu dicatat bahwa cyto-hibrida yang diciptakan oleh peleburan sel teratokarsinoma dengan fibroblas berhubungan dengan fibroblas sesuai dengan fenotipe.

Fakta utama yang paling penting adalah bahwa pada sel hama teratokarsinoma-somatik, muncul tanda-tanda reprogramming genom sel yang terdiferensiasi, yang ditandai dengan pengaktifan kembali gen individual atau kromosom X yang tidak aktif dari pasangan somatik. Dengan demikian, hasil penelitian tentang sitohybridida seperti sel somatik teratocarcinomatic menunjukkan bahwa sel hibrid sering mempertahankan pluripotency dan ada tanda-tanda pemrograman ulang genom pasangan somatik.

Dalam percobaan mendapatkan sel hibrid embrion intraspesifik dengan peleburan ESK tikus dengan splenosit dari hewan dewasa, karakteristik sitohybridida tersebut dipelajari, pemisahan kromosom parental dianalisis, dan pluripotency genom hibrida diperkirakan. Untuk sel hibrid intraspecific yang diperoleh dari peleburan sel teratokarsinoma dengan sel somatik, tingkat segregasi kromosom rendah dengan kariotipe tetraploid atau hampir tetraploid khas. Komposisi kromosom yang serupa diamati pada sitohybrid oleh peleburan sel seks primer dengan limfosit. Pada saat yang sama, sel hibrid interspesifik diperoleh sebagai hasil peleburan sel teratokarsinoma tikus dengan limfosit mink, ditandai segregasi kromosom intensif dari pasangan somatik.

Sebuah panggung kualitatif baru dalam studi segregasi kromosom orangtua in hibrida interspesifik datang setelah pengembangan metode analisis mikrosatelit menggunakan polymerase chain reaction, dimana setiap kromosom tikus ditemukan beberapa ratus spidol, memungkinkan andal membedakan antara setiap pasangan kromosom homolog dalam sel hybrid.

Dengan menggabungkan ESK (menggunakan HM-1 sel kekurangan aktivitas gipoksantinfosforiboziltransferazy, 2n = 40, XY, terisolasi dari blastosis tikus galur 129 / 01a) dengan splenocytes dari tikus congenic garis DD / c gagal untuk menerima set klon hibrida morfologis harus kesamaan dengan hESCs. Semua klon diisolasi pada media selektif dimana hanya sel-sel dengan hipoksantin hefosibosiltransferase aktif yang dapat tumbuh. Analisis elektroforesis menunjukkan adanya pada semua klon dari varian allelic dari hypoxanthine phosphoribosyltransferase, karakteristik untuk tikus DD / c. Dengan menggunakan analisis sitogenetik, ditemukan bahwa dari empat klon hibrida, tiga memiliki rangkaian kromosom yang hampir diploid. Satu klon dekat-tetraploid mengandung dua populasi sel hibrida, salah satunya adalah tetraploid, dan yang kedua, yang lebih kecil, diploid.

Analisis mikrosatelit, yang memungkinkan pembedaan setiap pasangan kromosom homolog dari tikus 129 / 01a dan DD / c, dalam klon hibrida dengan himpunan near-diploid menunjukkan bahwa dalam dua klon ada eliminasi yang jelas dari autosom pasangan somatik. Kebanyakan autosom pada klon HESS2 dan HESS3 memiliki spidol pada garis 129 / 01a, yaitu pasangan pluripoten. Satu-satunya pengecualian adalah kromosom 1 dan I: klon HESS2 dan HESS3, bersamaan dengan penanda sel HM-1, berisi sejumlah kecil tanda dari pasangan somatik. Hasil tersebut mungkin mencerminkan ketidaklengkapan segregasi kromosom 1 dan 11 dari pasangan somatik dan konsisten dengan data sitogenetik bahwa trisomi pada kromosom ini diamati pada 30-40% sel klitor HESS2 dan HESS3. HESS4 clone berbeda secara signifikan dalam komposisi kromosom: banyak autosom klon ini berasal dari genom ESK (kromosom 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 dan 17), namun kromosom 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 dan 19 diwakili oleh homolog kedua orang tua. Rasio kuantitatif mikrosatelit yang melabelkan kromosom homolog ini kira-kira sesuai dengan 1: 1. Hal ini memungkinkan penulis untuk mengasumsikan bahwa satu homolog berasal dari genom ESC, dan yang lainnya dari sel yang terdiferensiasi. Pada beberapa subclone dari kloning HESS4, hanya penanda kromosom 18 dan 19 dari pasangan somatik yang hadir. Hasil menunjukkan bahwa sel-sel clone HESS4, selain segregasi kromosom mitra somatik, ada penghapusan salah satu atau kedua homolognya dari kromosom di atas pluripotent genom, yaitu, ada segregasi dua sisi dari kromosom dari kedua orang tua - fenomena ini sangat tidak biasa, karena tsitogibridov pemisahan karakteristik kromosom hanya salah satu orang tua

Selain itu, setelah bagian ke-20, semua klon sel hibrida berisi tanda X-kromosom eksklusif pasangan somatik, yaitu pada klon, kromosom X dari ESC diganti dengan kromosom X pasangan somatik. Hal ini dikonfirmasi oleh data hibridisasi in situ dengan menggunakan probe berlabel FITC yang spesifik untuk kromosom X tikus: sinyal positif terdeteksi hanya pada satu kromosom. Perlu dicatat bahwa pada tahap awal budidaya (sampai bagian ke 15), menurut data sitogenetik, di banyak sel ada dua kromosom X. Akibatnya, penggunaan media selektif memungkinkan untuk memanipulasi komposisi kromosom sel hibrida dan secara selektif menargetkan klon yang membawa kromosom tunggal pasangan somatik dengan latar belakang genom ESC.

Karena ciri unik dari genom cytohybrid adalah lokalisasi genom parental dalam satu nukleus, secara alami, timbul pertanyaan untuk melestarikan sifat pluripoten genom embrio pada hibrida sel somatik ESC dalam kondisi kontak dekat dengan genom sel yang terdiferensiasi. Secara morfologis, sitohybrid sel ESC dan somatik menyerupai garis induk ESC. Evaluasi pluripotency menunjukkan bahwa semua klon dengan sekumpulan kromosom yang hampir diploid mampu membentuk badan embrio dalam kultur suspensi dimana turunan dari tiga lembar germinal ada.

Sebagian besar sel hibrid mengandung antigen ECMA-7, karakteristik penanda embrio tikus awal, dan juga memiliki aktivitas alkalin fosfatase tinggi. Data yang paling meyakinkan mengenai sifat pluripoten tinggi sel hibrid diperoleh dalam percobaan untuk mendapatkan serangkaian chimeras injeksi yang melibatkan sel hibrid dari kloning HESS2. Analisis penanda biokimia menunjukkan bahwa keturunan sel hibrid donor ditemukan di sebagian besar jaringan chimera. Oleh karena itu, sel hibrid yang diperoleh dengan peleburan ESC dan sel-sel berbeda somatik mempertahankan pluripotency pada tingkat tinggi, termasuk kemampuan untuk membentuk chimeras saat dimasukkan ke dalam rongga blastokista.

Klon HESS2 dan HESS4 berbeda secara signifikan dalam komposisi kromosom induk, namun memiliki sifat pluripoten serupa. Orang bisa percaya bahwa pluripotency dalam genom hibrida memanifestasikan dirinya sebagai atribut dominan, namun ada kemungkinan bahwa tidak semua kromosom genom embrio terlibat dalam proses mempertahankan pluripotency. Jika asumsi ini benar, seseorang dapat berharap bahwa penghapusan beberapa kromosom pasangan pluripoten dari genom hibridoma tidak akan disertai dengan perubahan status pluripoten mereka. Dalam kasus ini, analisis segregasi kromosom parental pada sel hibrid embrionik akan memungkinkan pendekatan yang mendekati identifikasi kromosom yang bertanggung jawab untuk mengendalikan pluripotency sel embrio.

O. Serov dan rekan penulis (2001) tidak menemukan di antara 50 keturunan yang diperoleh dengan menyeberangi chimeras dengan tikus normal, seperti memiliki genotipe tikus 129 / 01a dan membawa kromosom X tikus DD. Penulis melihat alasannya dalam pengurangan pluripotency pada sel hibrida di bawah pengaruh genom somatik. Penjelasan alternatif mungkin adalah efek negatif trisomi pada beberapa autosom dan ketidakseimbangan kromosom seks (XXY diamati pada sel sebelum paragraf ke 15) pada sel hibrida saat mereka melewati meiosis. Diketahui bahwa sel XXY tidak bisa melewati meiosis dan membentuk gamet. Trisomi juga mampu menyebabkan penurunan aktivitas proliferatif sel hibrid, akibatnya keuntungan selektif dalam pengembangan chimeras bisa masuk ke dalam sel embrio penerima. Dengan demikian untuk mengevaluasi secara memadai potensi pluripoten sel hibrid, perlu untuk mendapatkan klon hibrida dengan seperangkat kromosom diploid yang normal.

Dalam percobaan O. Serov dan rekan penulis (2001), kemungkinan memprogram ulang kromosom X dari sel somatik dalam genom sel hibrida telah ditunjukkan untuk pertama kalinya. Kesimpulan ini mengikuti analisis ekspresi gen hprt (penanda kromosom X) pada chimeras: adanya varian allelic pada tikus hdt DD / c ditemukan pada semua jaringan chimeric yang dianalisis. Perlu ditekankan bahwa setelah pengenalan sel hibrid dalam rongga blastokista tsitogibridy jatuh dalam kondisi non-selektif dan pelestarian kromosom X dalam genom sel hibrida berarti bahwa itu telah menjadi komponen wajib dari genom dan tidak melakukan diskriminasi itu dari Y mitra kromosom pluripotent.

Merangkum hasil analisis interaksi genom somatik dan pluripoten pada sel embrio embrio, para penulis menyimpulkan bahwa pada beberapa penyakit pluripotensi cytohybrids memanifestasikan dirinya sebagai sifat dominan. Genom hibrida mampu memprogram ulang kromosom individual dari sel yang berbeda, yang bagaimanapun tidak menyingkirkan kemungkinan adanya efek sebaliknya dari genom somatik pada pluripotensi genom embrio. Dalam budidaya sel hibrida, induksi diferensiasi terjadi lebih sering daripada pada garis induk asli ESC NM-1. Efek yang sama diamati pada pembentukan kolon primer: banyak koloni primer sel hibrid embrionik membedakan pada tahap awal pembentukan dengan banyak kehilangan klon selama seleksi dan perkaliannya.

Dengan demikian, sitohybrida yang diciptakan oleh peleburan ESCs dengan sel somatik, walaupun memiliki kontak erat dengan genom sel yang berbeda, mempertahankan pluripotency sebagai properti unik dari genom embrio. Selain itu, pada sel hibrid tersebut, adalah mungkin untuk memprogram ulang kromosom individu yang berasal dari sel yang terdifusi. Masih belum jelas bagaimana sepenuhnya sifat pluripoten dari genom embrio dalam sel hibrida bertahan, khususnya, kemampuan mereka untuk berpartisipasi dalam pembentukan jalur embrio di chimeras. Untuk ini, perlu untuk mendapatkan sel hibrid embrionik dengan kariotipe normal. Bagaimanapun, sel hibrida embrio pluripoten bisa menjadi model genetik nyata untuk identifikasi kromosom yang terlibat dalam mempertahankan pluripotency atau pengontrolannya, karena pemisahan dua sisi kromosom parental berpotensi memberikan kesempatan semacam itu.

Yang tidak kalah menarik adalah studi tentang fenomena tersebut, yang oleh O. Serov dan rekan penulisnya (2001) didefinisikan sebagai "memori kromosom". Dalam genom hibrida, kromosom homolog berada dalam dua konfigurasi alternatif: homolog dari pasangan somatik pernah dibedakan, sedangkan pada homolog pasangan pluripoten, proses ini baru saja dimulai. Akibatnya, ketekunan sifat pluripoten tinggi oleh sel hibrida menunjukkan bahwa konfigurasi "pluripoten" homolog ESC cukup stabil dalam genom hibrida, terlepas dari pengaruh faktor pemancar yang berasal dari pasangan somatik. Tanda-tanda reprogramming kromosom homolog dari genom terdiferensiasi di dalam pengembangan chimeras tidak menggambarkan fakta bahwa pada tahap pertama pembentukan dan kultivasi sitohybrida secara in vitro, mereka mempertahankan statusnya selama diferensiasi in vivo. Menurut data yang baru diperoleh, ketika sel hibrida embrio dipindahkan ke media nonselektif, eliminasi kromosom secara intensif dari hanya pasangan somatik diamati di dalamnya, yaitu genom sel hibrid dengan mudah membedakan homolog setelah kultur in vitro selama 10-15 bagian. Dengan demikian, sel hibrida embrio mewakili model eksperimental yang menjanjikan untuk mempelajari tidak hanya properti mendasar dari genom embrio seperti pluripotency, tetapi juga alternatifnya - diferensiasi embrio.

Efikasi terapeutik transplantasi sel induk embrionik

Sebelum menganalisis efikasi terapeutik transplantasi ESC dan turunannya, kami meringkas bahan di atas. Fitur ESC dalam hal implementasi penuh dari embriogenesis in vitro tidak mencukupi karena cacat dalam hal ini karena tidak adanya sel-sel induk mesenchymal yang terjadi di dalam tubuh secara otonom dan independen dari hESCs. Potensi genetik ESC kurang dari potensi genetik zigot, oleh karena itu tidak secara langsung digunakan untuk kloning embrio. Potensi biologis unik ESC sebagai satu-satunya sel di mana program pengembangan digunakan dalam implementasi sekuensial penuh, menemukan aplikasi dalam penelitian tentang fungsi gen. Dengan bantuan ESC, kombinasi sinyal pertama yang mengaktifkan ekspresi gen awal dan akhir yang mengkodekan perkembangan tiga lembar embrio digambarkan. Pelestarian pluripotency genom ESC in vitro menjadikannya alat unik untuk regenerasi reparatif, yang dapat secara otomatis mengganti kerugian seluler dalam kerusakan organ dan jaringan. Dalam perwujudan hipotetis yang ideal dapat mengasumsikan bahwa "... Dalam transplantasi PGCs donor dalam organisme penerima ditransfer program kompak dikemas bahwa di bawah kondisi yang menguntungkan yang diwujudkan dalam pembangunan tkani'7 baru mampu" ... Secara efektif diintegrasikan ke dalam tubuh penerima sebagai morfologi, baik fungsional maupun fungsional. "

Tentu, mengikuti pengembangan metode untuk monodifferentiasi ESC, studi in vivo aktivitas fungsional sel yang diperoleh secara in vitro dari satu tiruan khusus dimulai. Klon ESO yang berkembang biak menghasilkan populasi sel progenitor yang bermigrasi yang benar-benar mampu secara aktif mengintegrasikan ke zona kerusakan jaringan penerima, yang digunakan dalam pengobatan plastik regeneratif. Telah ditetapkan bahwa transplantasi sel saraf Dopa di substantia nigra mengurangi manifestasi klinis pada hemiparkinsonianisme eksperimental. Transplantasi regional sel induk saraf donor mengurangi tingkat kelainan motor yang disebabkan oleh trauma atau kontraksi sumsum tulang belakang dan otak. Diterima dan hasil positif pertama dari transplantasi sel punca dalam penyakit demielinasi. Tampaknya potensi regeneratif-plastik ESCs membuka kemungkinan tak terbatas untuk menggunakan transplantasi seluler dalam pengobatan praktis. Namun, saat melakukan transplantasi ke daerah ektopik, ESCs pasti berubah menjadi tumor. Saat injeksi subkutan ESC pada teratoma tikus imunodefisien terbentuk. Bila suspensi ESK ditransplantasikan di bawah kapsul testis pada tikus syngeneic, teratoma juga terbentuk, terdiri dari jaringan yang berbeda, sel-selnya berasal dari ketiga selebaran embrio. Dalam teratoma seperti itu, proses organogenesis yang berkurang sangat jarang terjadi.

Sejumlah karya memberikan informasi tentang hasil positif transplantasi derivatif awal ESCOs kepada hewan dengan patologi eks-perimental. Sel neurotransplantasi menggunakan turunan ESC dikembangkan lebih lanjut dalam percobaan dan uji klinis pertama untuk memperbaiki kelainan fungsional pada cedera serebral dan tulang belakang, pengobatan syringomyelia dan multiple sclerosis (Repin, 2001). Dengan munculnya teknik neuronogenesis dari ESK in vitro, alih-alih menggunakan jaringan otak embrio, metode transplantasi derivatif neurospheres yang berasal dari kultur jaringan saraf embrio sedang dikembangkan. Suspensi transplantasi semacam itu jauh lebih homogen dan mengandung prekursor neuronal dan neuroglia yang sesuai.

Dengan penambahan asam retinoat secara teratur ke media kultur pada dosis 10 μg / ml selama 6 minggu, lebih dari 80% neuron postmitotik terbentuk pada garis embrio (terato-karsinoma) manusia NTERA-2. Homogenitas lengkap populasi neuron dicapai melalui penyortiran aliran penanda imunofenotipik yang ditandai oleh neuron dewasa, yang memungkinkan Anda menyingkirkan sisa-sisa teratokarsinoma dan sel yang belum matang. Setelah transplantasi ke berbagai daerah otak hewan percobaan, neuron tersebut tidak hanya bertahan, tapi juga dibangun ke dalam jaringan saraf daerah. Pada hewan dengan model eksperimental cacat lokal CNS neurotransplantation mengurangi manifestasi klinis patologi manusia seperti efek trauma craniocerebral, stroke, penyakit demielinasi, cacat perkembangan cerebellar keturunan, penyakit deposisi lipid dan polisakarida.

Untuk mengoptimalkan proses regenerasi pada penyakit degeneratif sistem saraf pusat, teknologi untuk persiapan oligodendrosit memproduksi myelin dari ESK sedang dikembangkan. Tahap pertama secara tradisional melibatkan proliferasi ESCs dengan perbanyakan jumlah sel yang diperlukan untuk transplantasi. Pada tahap kedua, diferensiasi sel yang diarahkan ke dalam populasi prekursor oligodendrocyte memproduksi myelin dilakukan, yang dikendalikan oleh antigen marker selektif.

Perspektif tertentu dibuka untuk penggunaan derivatif ESK untuk mengembangkan metode untuk memperbaiki kekebalan imun yang disebabkan oleh cacat genetik pada pematangan timus. Dalam penelitian di knockout (kain 1) tikus dengan induksi cacat gen - pelanggaran mekanisme rekombinasi V (D) gen J lokus TCR, yang menyebabkan hilangnya fungsi dari T-limfosit, transplantasi turunan awal PGCs di timus hewan pulih pematangan populasi normal klon kekebalan tubuh yang bertanggung jawab untuk imunitas selular Percobaan klinis transplantasi ESK in vitro preformed untuk pengobatan anemia herediter fatal pada anak dilakukan.

Keberatan terhadap pengenalan cepat transplantasi sel punca ke klinik dibenarkan oleh sejumlah baris stabil sel induk embrio manusia dan kebutuhan akan standarisasi mereka. Untuk meningkatkan kemurnian jalur ESC standar, serta sel induk dewasa, metode seleksi garis berdasarkan analisis genetika molekuler untuk pengulangan tandem singkat DNA disarankan. Hal ini juga diperlukan untuk menguji garis ESC untuk adanya penataan ulang kromosom kecil dan mutasi genetik, kemungkinan kemungkinan terjadinya kejadian di bawah kondisi budidaya sel cukup tinggi. Tesis tentang pengujian sifat wajib semua jenis ESC dan sel induk pluripoten regional sudah lanjut, karena reproduksi in vitro dapat menyebabkan munculnya karakteristik baru yang tidak melekat pada sel induk embrio atau jaringan definitif. Secara khusus, diperbolehkan bahwa berkultivasi yang berkepanjangan pada media sitokin mendekati garis ESK ke sel tumor, karena perubahan yang serupa dalam cara pengaturan siklus sel terjadi dengan perolehan kemampuan untuk melakukan pembelahan sel dalam jumlah tidak terbatas. Beberapa penulis, berdasarkan potensi pengembangan tumor, pertimbangkan transplantasi manusia terhadap turunan awal sel induk embrionik sebagai kecerobohan. Menurut pendapat mereka, jauh lebih aman untuk menggunakan keturunan berkomitmen dari ESC, yaitu garis keturunan dari sel yang terdiferensiasi. Namun, teknik yang andal untuk mendapatkan garis sel manusia yang stabil yang berdiferensiasi pada arah yang benar belum dikembangkan.

Jadi, dalam literatur ada lebih banyak data tentang efek terapeutik positif dari transplantasi turunan sel induk embrionik manusia. Namun, banyak dari karya ini tunduk pada revisi dan kritik. Beberapa periset percaya bahwa hasil uji klinis awal bersifat sementara dan hanya menyarankan bahwa sel induk dapat memberi efek menguntungkan pada perjalanan penyakit klinis. Oleh karena itu, perlu untuk mendapatkan data hasil transplantasi sel jangka panjang. Sebagai argumen, tahap perkembangan neurotransplantasiologi klinis diberikan. Memang, dalam literatur, publikasi tentang tingginya efisiensi pencangkokan fragmen otak embrio pada penyakit Parkinson pada awalnya terjadi, namun kemudian laporan mulai muncul yang menolak keefektifan terapeutik jaringan saraf embrio atau janin yang ditransplantasikan ke otak pasien.

Percobaan klinis pertama dilakukan untuk menilai keamanan transplantasi neuroblas - turunan ESK yang diturunkan dari NTERA-2 yang teratocarcinoma, sel-sel belum matang yang mengalami proliferasi dalam kultur sebelum akumulasi 100 juta massa sel. Beberapa sel yang diperoleh digunakan untuk mengkarakterisasi fenotipe dan untuk menentukan kotoran sel, serta untuk menguji kemungkinan kontaminasi oleh virus dan bakteri. LIF dan lapisan umpan sel janin stroma dikeluarkan dari medium dan kondisi kultur diciptakan untuk diferensiasi yang ditargetkan dari ESC menjadi neuroblasts oleh kombinasi sitokin dan faktor pertumbuhan. Kemudian, neuroblasts dimurnikan dari sel teratokarsinoma yang belum matang pada penyortir sangkar aliran. Setelah pemurnian kedua dan karakterisasi fenotip sel neuroblasts ditransplantasikan (10-12 jutaan) suspensi menggunakan jarum suntik dan microcannulas khusus stereotaxy dan di bawah kendali CT disuntikkan ke dalam nucleus basalis dari otak pasien (bulan ketujuh setelah stroke hemoragik). Transplantasi pasca-transplantasi satu tahun efek transplantasi neuron di zona stroke tidak menunjukkan efek samping dan efek yang tidak diinginkan. Setengah dari pasien mengalami peningkatan fungsi motor dalam kurun waktu 6 sampai 12 bulan setelah transplantasi. Perubahan klinis positif disertai dengan peningkatan suplai darah ke zona stroke setelah transplantasi sel: peningkatan rata-rata penyerapan 2-deoxyglucose berlabel fluorescently, menurut positron emission tomography, mencapai 18%, dan pada masing-masing pasien - 35%.

Namun, Institut Kesehatan Nasional AS melakukan studi independen tentang keampuhan klinis neurotransplantasi pada pasien Parkinsonisme. Pasien pada kelompok pertama ditransplantasikan dengan jaringan saraf embrio yang menghasilkan dopamin, sementara kelompok kedua pasien menjalani operasi palsu. Hasilnya menunjukkan keefektifan klinis nol dari neurotransplantasi semacam itu, terlepas dari fakta bahwa neuron embrionik penghasil dopamin bertahan di otak penerima. Selain itu, 2 tahun setelah transplantasi jaringan embrio, 15% pasien mengembangkan diskinesia yang persisten, yang tidak ada pada pasien kelompok plasebo (sel induk: kemajuan ilmiah dan arah penelitian masa depan., Nat. Inst, Health, USA). Pengamatan perkembangan lebih lanjut penyakit pada pasien ini berlanjut.

Beberapa penulis menghubungkan inkonsistensi data literatur mengenai evaluasi keampuhan klinis neurotransplantasi dengan pendekatan yang berbeda terhadap pemilihan kelompok pasien, pilihan metode yang tidak memadai untuk penilaian objektif terhadap kondisi mereka, dan yang terpenting, berbagai jenis perkembangan jaringan saraf embrio dan bagian otak yang berbeda dari mana jaringan ini diperoleh, transplantasi dan fitur metodis operasi.

Perlu dicatat bahwa upaya untuk secara langsung mentransplantasi sel embrio pluripoten ke dalam striatum otak tikus dengan hemiparkinsonisme eksperimental disertai dengan proliferasi ESC dan diferensiasinya menjadi neuron dopaminergik. Harus diasumsikan bahwa neuron yang baru terbentuk secara efektif dibangun ke dalam jaringan neuron, karena setelah transplantasi ESC, koreksi anomali perilaku dan asimetri motor dalam uji apomorphine diamati. Pada saat bersamaan, beberapa hewan meninggal akibat transformasi ESK yang ditransplantasikan di tumor otak.

Para ahli dari National dan Akademi Kedokteran AS, spesialis dari National Institutes of Health percaya bahwa potensi klinis hESCs layak mendapat perhatian serius, bagaimanapun, bersikeras pada kebutuhan untuk studi rinci sifat-sifat mereka, kemungkinan komplikasi dan efek jangka panjang dalam eksperimen dengan model biologis yang memadai dari penyakit manusia (sel Stem dan obat regeneratif masa depan National Academy Press, sel induk dan arah penelitian masa depan., Nat. Inst, Health USA).

Dari sudut pandang ini, penting bahwa analisis histologis komparatif terhadap teratoma eksperimental yang diperoleh selama transplantasi di testis suspensi ESC, dengan teratoma terbentuk sebagai hasil transplantasi embrio awal, yang juga mengandung ESC, menunjukkan bahwa ESC, terlepas dari sumber asal atau interaksi mereka dengan oleh mereka atau sel sekitarnya lainnya dengan cara yang sama menyadari potensi tumorigenik mereka. Telah terbukti bahwa teratoma semacam itu berasal dari klonal, karena tumor yang terdiri dari turunan dari ketiga selebaran embrio dapat muncul dari satu ESC. (Peera, 2001). Perlu dicatat bahwa ketika mencangkok tikus immunodeficient mengkloning ESK dengan kariotipe normal, teratoma juga terbentuk, yang terdiri dari berbagai jenis sel somatik yang terdiferensiasi. Data eksperimental ini adalah bukti sempurna dari asal mula klonal teratom. Dari sudut pandang biologi perkembangan, mereka menunjukkan bahwa tidak ada beberapa sel prekursor yang berpengalaman, namun sel induk pluripoten tunggal, bertindak sebagai sumber turunan terdiferensiasi dari ketiga daun embrionik yang merupakan teratoma. Namun, di jalan transplantasi sel praktis, hasil penelitian ini adalah, jika bukan penghalang, maka tanda peringatan akan bahaya potensial, karena inokulasi ESC atau sel kuman primer ke dalam jaringan yang berbeda dari tikus imunodefisien dewasa pasti menyebabkan perkembangan tumor dari sel induk yang ditransplantasikan. Degenerasi neoplastik ESC yang ditransplantasikan secara simbion disertai dengan munculnya populasi sel diferensiasi satelit - karena diferensiasi parsial klon ESC dan progenitor menjadi jalur khusus. Menariknya, saat transplantasi ESC ke otot rangka di samping sel teratokarsinoma, neuron paling sering terbentuk. Namun, pengenalan ESC ke dalam sel telur atau blastokista yang dilumasi disertai oleh integrasi sel ke dalam embrio tanpa pembentukan elemen neoplastik. Dalam kasus ini, ESC dibangun ke hampir semua organ dan jaringan embrio, termasuk rudiment seksual. Hewan allophenic tersebut pertama kali diperoleh dengan memasukkan sel teratokarsinoma ke embrio awal pada tahap 8-100 sel. Pada tikus alofenik, populasi donor ESK yang berasal dari heterogen diperkenalkan ke dalam jaringan sumsum tulang, usus, kulit, organ hati dan genital, yang memungkinkan untuk menciptakan chimera seluler interspesifik sekalipun dalam percobaan. Semakin pendek perkembangan embrio awal, semakin tinggi persentase chimerisasi seluler, dengan tingkat chimerisasi tertinggi diamati pada sistem hematopoietik, kulit, sistem saraf, hati dan usus kecil embrio alofan. Pada organisme dewasa chimerisasi, jaringan yang terlindungi dari sistem kekebalan penerima dengan penghalang histohematologis rentan: transplantasi sel kuman primer ke dalam parenkim testis disertai penyisipan sel induk donor ke lapisan hermetik jaringan penerima. Namun demikian, dengan transplantasi ESC ke blastokista, pembentukan dasar chimeric organ genital dengan generasi sel seksual primer donor tidak terjadi. Pluripotency ESC dalam menciptakan kondisi khusus juga dapat digunakan untuk kloning: transplantasi tikus ESK ke dalam embrio murine 8-16-sel, sel mitose yang diblokir oleh cytalocalin, memfasilitasi realisasi embriogenesis normal dengan perkembangan embrio dari donor ESC.

Oleh karena itu, alternatif untuk transplantasi ESK alogenik adalah kloning terapeutik berdasarkan transplantasi inti sel somatik ke dalam telur yang enukleat untuk menciptakan blastokista, dari massa sel dalam yang kemudian garis genetik identik dengan donor inti somatik ESC diisolasi. Secara teknis, ide ini cukup layak dilakukan, karena kemungkinan menciptakan jalur ESK dari blastokista yang diperoleh setelah transplantasi inti somatik menjadi telur enukleat telah berulang kali terbukti dalam eksperimen pada hewan laboratorium (Nagy, 1990, Munsie, 2000). Secara khusus, pada tikus homozigot untuk mutasi gen rag2, fibroblas yang diperoleh dengan membiakkan sel-sel jaringan subepidermal digunakan sebagai donor nukleus yang dipindahkan ke oosit yang enukleasi. Setelah aktivasi oosit, zigot dikultur untuk membentuk blastokista, dari mana massa sel dalam diisolasi oleh ESCs dan dipindahkan ke jalur Nullizygotes oleh gen sel mutan (rag2 ~ / ~). Dengan rekombinasi homolog di ESC semacam itu, mutasi satu gen allelic dikoreksi. Pada rangkaian percobaan pertama, tubuh embrio diperoleh dari ESC dengan genom yang direkonstitusi rekombinan, sel mereka diteruskan dengan retrovirus rekombinan (HoxB4i / GFP), dan setelah perkalian, mereka dimasukkan ke dalam pembuluh darah tikus. Pada seri kedua, blastomeres tetraploid dikumpulkan dengan ESC yang dimodifikasi secara genetik dan dipindahkan ke penerima wanita mereka. Tikus imunokompeten yang lahir berperan sebagai donor sumsum tulang untuk transplantasi tikus mutan. Pada kedua seri, hasilnya positif: dalam 3-4 minggu, semua tikus dewasa ditemukan memiliki sel myeloid normal dan limfoid normal yang mampu menghasilkan imunoglobulin. Dengan demikian, transplantasi ke dalam oosit inti sel somatik dapat digunakan tidak hanya untuk mendapatkan garis ESC, tetapi juga untuk sitogenoterapi - koreksi anomali keturunan, dengan menggunakan ESC sebagai vektor untuk pengangkutan informasi genetik korektif. Tapi dalam arah transplantasi sel ini, selain masalah bioetika, ada keterbatasan. Tidak jelas seberapa aman transplantasi sel kloning terapeutik dengan genotipe yang identik dengan pasien tertentu, karena sel tersebut dapat mengenalkan mutasi yang menjadi predisposisi penyakit lainnya. Ovul manusia normal tetap menjadi objek yang sulit dijangkau, sedangkan bahkan ketika inti somatik ditransplantasikan ke dalam hewan ovum yang enukleasi, hanya 15-25% "zygotes" yang dibangun berkembang ke tahap blastokista. Tidak ditentukan berapa banyak blastokista yang dibutuhkan untuk mendapatkan satu baris plitipoten kloning ESCs. Perlu dicatat dan tingginya tingkat biaya keuangan yang terkait dengan kompleksitas metodologi kloning terapeutik.

Kesimpulannya, di ESC pluripotency genom hypomethylated DNA dikombinasikan dengan aktivitas telomerase yang tinggi dan fase C ^ siklus sel pendek, yang menjamin perkalian intensif dan berpotensi tak terbatas, di mana PGCs mempertahankan kromosom diploid dan "remaja" set karakteristik fenotipik. Pertumbuhan Clonal ESC dalam kultur tidak mencegah diferensiasi mereka ke dalam rangkaian sel khusus organisme saat proliferasi berhenti dan sinyal peraturan terkait ditambahkan. Diferensiasi ESC yang terbatas pada sel somatik in vitro direalisasikan tanpa partisipasi mesenkim, melewati Nokhteiov, organogenesis luar dan tanpa pembentukan embrio. Administrasi eskip ESC secara in vivo pasti mengarah pada pembentukan teratokarsinoma. Transplantasi ESC ke dalam blastokista atau embrio awal disertai dengan integrasi mereka dengan jaringan embrio dan kimulasi stabil organ-organnya.

Teknologi plastik regeneratif berdasarkan transplantasi sel adalah titik persimpangan kepentingan perwakilan biologi sel, biologi perkembangan, genetika eksperimental, imunologi, neurologi, kardiologi, hematologi dan banyak cabang pengobatan eksperimental dan praktis lainnya. Yang paling penting adalah hasil studi eksperimental yang membuktikan kemungkinan memprogram ulang sel punca dengan perubahan arah pada propertinya, yang membuka prospek untuk mengelola proses sitodifferensial dengan bantuan faktor pertumbuhan - untuk regenerasi miokard, pemulihan lesi SSP, dan normalisasi fungsi aparatus pulau pankreas. Namun, untuk pengenalan transplantasi derivatif ESK yang luas ke dalam pengobatan praktis, perlu untuk mempelajari secara lebih rinci sifat-sifat sel induk manusia dan melanjutkan eksperimen dengan ESC dalam model penyakit eksperimental.

Masalah bioetika dan masalah penolakan terhadap transplantasi sel alogenik dapat diatasi dengan plastisitas terungkap dari genom sel induk regional dari organisme dewasa. Namun, informasi awal bahwa ketika ditransplantasikan ke dalam hati diisolasi dan dicirikan secara hati-hati sel autogenous hematopoietik, dari mana hepatosit baru dibangun ke dalam lobulus hati, sekarang sedang direvisi dan dikritik. Namun, data yang diterbitkan bahwa transplantasi sel induk saraf di timus adalah pembentukan kecambah baru donor T dan-B-limfosit, dan transplantasi sel induk saraf otak di sumsum tulang mengarah pada pembentukan hematopoietik kuman berkelanjutan myeloid donor dan eritropoiesis . Akibatnya, pada organ-organ organisme dewasa sel induk pluripoten mampu memprogram ulang genom ke potensi ESC dapat dipertahankan.

Embrio manusia tetap menjadi sumber untuk menerima ESC untuk tujuan medis, yang menentukan kemungkinan perpecahan baru dari masalah moral, etika, moral, hukum dan agama pada saat kelahiran kehidupan manusia. Penemuan ESC memberi dorongan kuat untuk memulai kembali diskusi yang sulit mengenai di mana garis antara sel hidup dan materi, substansi dan kepribadian berada. Pada saat yang sama, tidak ada norma, peraturan, dan undang-undang universal mengenai penggunaan ESC dalam pengobatan, meskipun berulang kali mencoba untuk menciptakan dan menerimanya. Setiap negara bagian dalam undang-undangnya memecahkan masalah ini sendiri. Bagi mereka, para dokter dari seluruh dunia terus mencoba mengembangkan obat plastik regeneratif di luar diskusi semacam itu, terutama melalui penggunaan sel induk non-embrio, dan cadangan sel induk dari organisme dewasa.

Beberapa riwayat isolasi sel induk embrionik

Terato- (embrio) sel diisolasi dari -kartsinomnye spontan terjadi testis ketegangan teratoma tikus 129 sel / ter-Sv, spontan ovarium garis teratoma tikus Lt / Sv, dan dari teratoma, sumber ektopichno ditransplantasikan atau jaringan embrio. Di antara yang diperoleh terato- garis stabil tikus (embrio) -kartsinomnyh beberapa sel yang pluripoten, orang lain menjadi sasaran diferensiasi hanya dalam sel dari satu jenis tertentu, dan beberapa telah umumnya mampu cytodifferentiation.

Pada suatu waktu, penelitian difokuskan pada kemungkinan kembalinya sel terato-embrio-karsinoma ke fenotipe normal setelah diperkenalkan ke dalam jaringan embrio yang sedang berkembang, serta bekerja pada penciptaan in vitro dari sel ter-embrio-karsinoma yang dimodifikasi secara genetis. Sel, dengan bantuan tikus mutan yang diperoleh untuk pemodelan biologis patologi turun temurun manusia.

Budidaya suspensi yang dikondisikan digunakan untuk mengisolasi jalur sel terato-embrio-karsinoma. Dalam terato- budaya (embrio) -kartsinomnye sel, seperti ESCs, tumbuh untuk membentuk tubuh embryoid dan perlu diterjemahkan menjadi garis disosiasi mengikat mempertahankan pluripotency pada lapisan pengumpan fibroblast embrio atau kultur suspensi media terkondisi. Sel-sel dari jalur karsinoma terato-embrio-pluripoten berukuran besar, berbentuk bola, ditandai dengan aktivitas alkalin fosfatase yang tinggi, membentuk agregat dan mampu mengalami diferensiasi multidirectional. Ketika diperkenalkan ke blastocyst dikumpulkan dengan morulae, menghasilkan pembentukan embrio chimeric, dalam berbagai organ dan jaringan yang turunannya ditemukan terato- (embrio) sel -kartsinomnyh. Namun, sebagian besar embrio chimeric tersebut mati dalam kandungan, dan di organ bertahan dari chimera yang baru lahir, sel asing jarang terdeteksi dan dengan kepadatan rendah. Pada saat yang sama insiden tumor (fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, dan jenis-jenis pembengkakan ganas dan adenoma Pankreas) tajam meningkat, dan degenerasi neoplastik sering terjadi bahkan dalam rahim embrio chimeric.

Sebagian besar sel tero-embrio-karsinoma di lingkungan mikro sel embrio normal hampir secara alami memperoleh karakteristik neoplastik ganas. Dipercaya bahwa keganasan ireversibel disebabkan oleh aktivasi proto-onkogen dalam proses penataan ulang struktur. Satu pengecualian adalah garis sel embryocarcinoma SST3, yang berasal dari testis murine (garis 129 / Sv-ter), yang menunjukkan kemampuan tinggi untuk berintegrasi ke dalam jaringan dan organ embrio tanpa pembentukan tumor berikutnya pada tikus chimeric. Derivat garis terato-embrio-karsinoma pada tikus chimera praktis tidak berperan dalam pembentukan gonosit primer. Jelas, ini disebabkan oleh frekuensi penyimpangan kromosom frekuensi yang sangat tinggi dari garis karsinoma terato- (embrio), di sel-sel dimana kelainan aneuploidi dan kromosom diamati.

Di laboratorium, beberapa garis stabil terapis-embrio-karsinoma manusia, ditandai dengan pluripotency, aktivitas proliferasi tinggi dan kemampuan untuk membedakan dengan pertumbuhan dalam budaya, diperoleh. Secara khusus, garis sel terato-embrio-karsinoma manusia NTERA-2 digunakan untuk mempelajari mekanisme sitodifferentiasi saraf. Setelah transplantasi sel dari saluran ini ke daerah subventrikular otak depan tikus yang baru lahir, migrasi dan neuronogenesis mereka diamati. Bahkan upaya dilakukan untuk mentransplantasikan neuron yang diperoleh dengan membiakkan sel-sel dari garis terato-embrio-karsinoma NTERA-2, pasien dengan stroke, yang menurut para penulis, menyebabkan perbaikan pada perjalanan klinis penyakit ini. Dalam kasus ini, kasus keganasan sel transplantasi garis terato-embrio-karsinoma NTERA-2 pada pasien dengan stroke tidak dicatat.

Evans dan Martin menerima baris pertama dari sel induk embrio embrio yang tidak berdiferensiasi dari tikus pada awal tahun 80an abad lalu, mengisolasi mereka dari massa sel internal blastokista, embryoblast. Garis ESC yang terisolasi untuk waktu yang lama diawetkan pluripotency dan kemampuan untuk membedakan ke berbagai jenis sel di bawah pengaruh faktor media kultur khusus.

Istilah "embrio pluripotent stem cell" milik Leroy Stevens bahwa penyelidikan dampak tar tembakau pada frekuensi perkembangan tumor menarik perhatian pada terjadinya teratokarsinoma spontan testis linear (129 / v) tikus dari kelompok kontrol. Sel-sel teratokarsinoma testis yang ditandai dengan tingkat proliferasi yang tinggi, dan dengan adanya cairan yang tersisa di rongga perut dengan pembentukan diferensiasi spontan neuron, keratinosit, kondrosit, kardiomiosit, serta rambut dan fragmen tulang, tetapi tanpa indikasi cytoarchitectonics memerintahkan jaringan yang sesuai. Ketika menanam dalam kultur sel teratokarsinoma tumbuh terikat dengan klon pluripotent substrat dan membentuk tubuh embryoid kemudian padam dan mengalami spontan fisi tertib berdiferensiasi menjadi neuron, glia, sel-sel otot dan kardiomiosit. Stevens menemukan bahwa teratokarsinoma tikus 129 / v mengandung kurang dari 1% dari sel-sel yang mampu membedakan menjadi berbagai lini somatik khusus, dan dirinya sendiri diferensiasi tergantung pada faktor-faktor yang mempengaruhi mereka (komposisi cairan peritoneal, produk ditambahkan ke kultur sel-sel atau jaringan dewasa). Leroy Stevenson asumsi tentang keberadaan antara sel-sel teratokarsinoma embrio progenitor sel germinal seksual dikonfirmasi: suspensi embryoblast sel embrio praimplantasi dalam jaringan tikus dewasa terbentuk teratokarsinoma, dan terpisah dari mereka garis sel murni setelah pemberian intraperitoneal untuk hewan penerima telah dibedakan menjadi neuron, kardiomiosit dan kletki somatik lainnya turunan dari semua tiga lapisan kuman. Dalam percobaan transplantasi vivo ESK (diperoleh dari embryoblast tetapi tidak trofoblas) di embrio tikus di berbagai lini tahap 8-32 blastomer berakhir kelahiran hewan chimeric (tidak ada pembentukan tumor) di organ yang mendeteksi jaringan kecambah donor. Chimerism diamati bahkan di garis sel kelamin.

Sel kuman progenitorial primer yang diisolasi dari kuman genital embrio tikus, menurut morfologi, fenotipe imunologis dan karakteristik fungsional, sesuai dengan STS yang diperoleh Stevenson dari teratocarcinoma dan embryoblast. Pada chimeras yang lahir setelah pemberian ESC ke blastokista, morfogenesis alofrenik organ-organ dicirikan oleh suatu pergantian mosaik unit struktural dan fungsional donor dan penerima dari hati, paru-paru, dan ginjal. Dalam sejumlah kasus, pembentukan kriptus usus atau lobulus hati, yang terdiri bersamaan dari sel penerima dan donor, diamati. Namun, selalu realisasi morfogenesis terjadi sesuai dengan program genetik spesies tempat penerima berada, dan chimerism hanya terbatas pada tingkat sel.

Kemudian, ditemukan bahwa proliferasi hESCs tanpa cytodifferentiation pada pengumpan sel mesenchymal lapisan yang diturunkan (fibroblas janin) terjadi di hadapan LIF mengikat dalam media nutrisi selektif yang selektif hanya memberikan kelangsungan hidup sel-sel induk dan progenitor, sementara sebagian besar elemen selular khusus meninggal. Dengan bantuan teknik ini pada tahun 1998 oleh James Thomson dialokasikan lima baris diabadikan sel induk embrionik dari inner cell mass dari orang blastokista. Pada tahun yang sama, John Gerhart telah mengembangkan metode mengisolasi garis ESC abadi dari kepulan seksual dari embrio manusia empat-lima minggu. Karena sifat unik, hanya dua tahun kemudian embrio stem sel dan sel induk jaringan definitif sudah mulai digunakan dalam praktek kedokteran regeneratif dan terapi gen.