Diagnosis laboratorium untuk tuberkulosis

Tuberkulosis merupakan penyakit yang mudah didiagnosis dalam kondisi modern dan kemajuan ilmu pengetahuan. Diagnosis laboratorium tuberkulosis menempati tempat utama di antara metode diagnostik lainnya, kedua setelah metode pemeriksaan sinar-X.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Tes darah klinis

Pada pasien tuberkulosis, perubahan dalam tes darah umum tidak patognomonik. Pada bentuk tuberkulosis terbatas dan aktif rendah, hipokromia eritrosit dengan jumlah normal merupakan karakteristik. Pada infiltrat masif atau pneumonia kaseosa, dengan limfadenitis kaseosa yang meluas, kerusakan usus spesifik, serta dengan perdarahan paru atau pascaoperasi yang besar, eritropenia dan mikrositosis, oligokromasia, polikromasia dicatat. Makrositosis, dan terutama poikilositosis, lebih jarang ditemui, biasanya dengan anemia berat. Jumlah retikulosit pada tahap tuberkulosis terkompensasi bervariasi dari 0,1 hingga 0,6%, pada tahap subkompensasi - dari 0,6 hingga 1,0%, dan untuk tahap dekompensasi, 1% retikulosit merupakan karakteristik.

Pada beberapa kasus tuberkulosis, leukositosis sedang (hingga 15 ribu leukosit) dapat diamati, lebih jarang leukopenia, yang terjadi pada 2-7% kasus pada pasien dengan bentuk proses yang terbatas dan ringan dan pada 12,5% pada tuberkulosis paru yang destruktif dan progresif.

Paling sering, pergeseran terjadi pada formula leukosit. Baik neutrofilia relatif maupun absolut dicatat, pergeseran sedang dalam formula leukosit ke kiri ke promielosit. Mielosit sangat jarang ditemukan pada kasus tuberkulosis tanpa komplikasi. Peningkatan jumlah neutrofil dengan granularitas patologis dalam hemogram pasien tuberkulosis selalu menunjukkan durasi proses: pada pasien tuberkulosis berat, hampir semua neutrofil mengandung granularitas patologis. Ketika wabah tuberkulosis mereda, pergeseran nuklir kembali normal relatif cepat. Granularitas patologis neutrofil biasanya bertahan lebih lama daripada perubahan lain dalam hemogram.

Kandungan eosinofil dalam darah tepi juga berfluktuasi tergantung pada fase proses dan status alergi organisme. Jumlahnya menurun menjadi aneosinofilia pada wabah penyakit yang parah dan berkepanjangan dan, sebaliknya, meningkat selama resorpsi infiltrat dan efusi pleura, serta pada bentuk awal tuberkulosis primer.

Sebagian besar bentuk tuberkulosis primer disertai limfopenia, yang terkadang terjadi selama beberapa tahun bahkan setelah terbentuknya jaringan parut akibat perubahan tertentu. Tuberkulosis sekunder pada fase akut, tergantung pada tingkat keparahan prosesnya, dapat disertai dengan jumlah limfosit yang normal atau limfopenia.

Di antara tes untuk menilai proses tuberkulosis, tempat khusus ditempati oleh penentuan laju sedimentasi eritrosit (LED), yang penting dalam menilai jalannya proses tuberkulosis dan mengidentifikasi bentuk aktifnya. Peningkatan LED menunjukkan adanya proses patologis (infeksi dan inflamasi, purulen, septik, hemoblastosis, limfogranulomatosis, dll.) dan berfungsi sebagai indikator tingkat keparahannya, tetapi nilai LED normal tidak selalu menunjukkan tidak adanya patologi. Percepatan sedimentasi eritrosit difasilitasi oleh peningkatan kandungan globulin, fibrinogen, kolesterol dalam darah dan penurunan viskositas darah. Perlambatan sedimentasi eritrosit merupakan karakteristik kondisi yang disertai dengan hemokonsentrasi, peningkatan kandungan albumin dan asam empedu.

Hemogram pasien tuberkulosis berubah selama pengobatan. Semakin berhasil intervensi terapeutik, semakin cepat perubahan hematologi menghilang. Pada saat yang sama, efek berbagai obat antibakteri pada hematopoiesis harus diperhatikan. Obat-obatan tersebut sering menyebabkan eosinofilia, dalam beberapa kasus - leukositosis, dan lebih sering leukopenia hingga agranulositosis dan reaksi limfoid-retikuler. Pemantauan hematologi sistematis dan analisis data yang diperoleh dengan benar sangat penting untuk menilai kondisi klinis pasien, dinamika proses, dan efektivitas pengobatan.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Analisis urin klinis

Dalam kasus tuberkulosis saluran kemih, analisis urin merupakan metode diagnostik laboratorium utama. Leukosituria, eritrosituria, proteinuria, hipoisostenuria, mikobakteriuria tuberkulosis, dan bakteriuria nonspesifik dapat diamati.

Leukosituria merupakan gejala tuberkulosis saluran kemih yang paling umum sebelum kemoterapi khusus dan tidak ada hanya pada kasus-kasus luar biasa, seperti obliterasi total lumen ureter. Uji Nechiporenko (penentuan jumlah leukosit dalam 1 ml urin) membantu menilai tingkat leukosituria secara lebih objektif pada nefrotuberkulosis, dan dalam beberapa kasus mendeteksinya dengan analisis urin umum yang normal. Namun, perlu diperhatikan bahwa leukosituria dapat terjadi pada pielonefritis akut dan kronis, sistitis, uretritis, batu ginjal, dan ureter.

Eritrosituria, seperti halnya leukosituria, dianggap sebagai salah satu tanda laboratorium tuberkulosis genitourinari yang paling umum. Frekuensi hematuria bergantung pada prevalensi proses tersebut; frekuensinya meningkat seiring dengan berkembangnya proses tuberkulosis destruktif di ginjal. Eritrosituria tanpa leukosituria lebih umum terjadi pada tahap awal tuberkulosis ginjal. Hematuria, yang lebih dominan daripada leukosituria, merupakan argumen penting yang mendukung tuberkulosis ginjal saat membedakannya dari pielonefritis nonspesifik.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Tes darah biokimia

Pada tuberkulosis, perubahan pada beberapa indeks biokimia bergantung terutama pada fase proses, komplikasi, dan berbagai penyakit penyerta. Pada pasien dengan tuberkulosis paru-paru dan organ lain yang tidak aktif, total protein dan fraksi protein serum darah tidak berubah dan menentukan kandungan normalnya.

Pada bentuk penyakit akut, juga pada eksaserbasi dan perkembangan bentuk tuberkulosis kronis, koefisien albumin-globulin menurun.

Yang sangat penting dalam menilai status fungsional dan kerusakan organik pada hati pada tuberkulosis dan komplikasinya adalah penentuan bilirubin langsung dan total, aspartat aminotransferase (AST), alanin aminotransferase (ALT) dalam serum darah. Penentuan dinamis tingkat aminotransferase. Bilirubin dalam pengobatan pasien tuberkulosis, terutama dalam bentuk yang parah, merupakan komponen wajib dari pemeriksaan biokimia pasien tuberkulosis dan dilakukan setiap bulan.

Evaluasi status fungsional ginjal meliputi penentuan kreatinin serum dan perhitungan laju filtrasi glomerulus menggunakan rumus Cockcroft-Gault. Perhitungan laju filtrasi glomerulus menggunakan uji Reberg memberikan hasil yang kurang akurat.

Tujuan utama studi biokimia dinamis pada pasien tuberkulosis adalah untuk memantau jalannya proses, mendeteksi efek samping obat secara tepat waktu, dan mengoreksi gangguan homeostasis yang muncul secara memadai.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

Penerapan metode penelitian biokimia pada tuberkulosis ekstra paru

Indikator yang paling informatif dianggap sebagai kandungan asam tuberkulostearat dalam cairan biologis, namun, penentuannya dikaitkan dengan kesulitan teknis (perlunya menggunakan kromatografi gas dan spektrometri massa).

Sangat menjanjikan untuk mengukur aktivitas adenosine deaminase - enzim yang ditentukan dalam cairan: sinovial, perikardial, asites atau serebrospinal. Penghasil utama adenosine deaminase adalah limfosit dan monosit. Penentuan aktivitas adenosine deaminase dalam cairan biologis memudahkan diagnosis sinovitis tuberkulosis, tuberkulosis kelenjar getah bening, meningitis tuberkulosis, serositis tuberkulosis.

Beberapa indikator biokimia, karena sifatnya yang tidak spesifik, hanya ditentukan dalam cairan biologis yang dekat dengan lesi. Kadar indikator diukur sebagai respons terhadap pemberian tuberkulin secara subkutan atau intradermal (biasanya sebelum pemberian dan 48 dan 72 jam setelahnya). Setelah ini, tingkat peningkatan kadar penanda (dalam %) dihitung dalam kaitannya dengan kadar awal.

Aktivitas enzim transamidinase spesifik organ secara optimal ditentukan dalam urin; kemunculannya dicatat dalam kerusakan ginjal dari berbagai asal. Studi transamidinase dibenarkan hanya dalam kondisi pemberian tuberkulin subkutan untuk memperburuk proses inflamasi lokal. Aktivitas transamidinase ditentukan dalam urin pada awalnya dan 24-72 jam setelah pemberian tuberkulin 50 TE. Peningkatan fermenturia sebanyak 2 kali atau lebih memungkinkan dalam 82% kasus untuk membedakan tuberkulosis ginjal aktif dari eksaserbasi pielonefritis kronis.

Dalam kasus tuberkulosis organ genital wanita, konsentrasi haptoglobin dan malondialdehid dalam darah ditentukan di bawah kondisi uji tuberkulin provokatif. Tuberkulin diberikan secara subkutan dengan dosis 50 TE dan studi biokimia ulang dilakukan setelah 72 jam. Dalam kasus etiologi tuberkulosis, tingkat peningkatan kadar haptoglobin setidaknya 28%, dan kadar malondialdehid adalah 39% atau lebih. Penentuan aktivitas adenosin deaminase dalam cairan peritoneum yang diperoleh dari kantong Douglas juga digunakan. Tusukan diperiksa lagi 72 jam setelah pemberian tuberkulin intradermal pada dosis 0,1 TE dan 0,01 TE di area proyeksi organ genital internal pada dinding perut anterior. Peningkatan aktivitas adenosin deaminase sebesar 10% atau lebih dibandingkan dengan nilai awal menunjukkan proses tuberkulosis.

Jika terjadi kerusakan mata, reaksi fokal yang terjadi di mata sebagai respons terhadap rangsangan antigen diperiksa. Dalam kasus ini, perkembangan respons yang diekspresikan secara tajam disertai dengan penurunan fungsi visual tidak diinginkan. Karena penilaian reaksi fokal minimal seringkali sulit, disarankan untuk fokus secara paralel pada tingkat peningkatan haptoglobin atau adenosin deaminase dalam serum darah untuk mengobjektifkan kesimpulan.

Semua studi biokimia harus dilakukan dalam kombinasi dengan metode lain.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

Studi sistem pembekuan darah

Relevansi kajian tentang kondisi sistem pembekuan darah dalam ilmu fisiologi adalah karena adanya hemoptisis atau perdarahan paru pada sejumlah pasien tuberkulosis paru, serta komplikasi hemokoagulasi dalam penanganan bedah tuberkulosis. Selain itu, hemokoagulasi intravaskular laten yang menyertai secara alamiah memengaruhi perjalanan penyakit dan efektivitas kemoterapi.

Pada pasien tuberkulosis paru dengan komponen eksudatif dominan peradangan, terjadi penurunan aktivitas antikoagulan darah. Pada pasien dengan prevalensi rendah kerusakan paru-paru spesifik dengan komponen peradangan produktif dominan, hemokoagulasi intravaskular diekspresikan secara tidak signifikan. Pada pasien tuberkulosis paru dengan hemoptisis dan perdarahan paru, keadaan sistem pembekuan darah berbeda: pada pasien dengan kehilangan darah ringan pada puncak hemoptoe atau segera setelah penghentiannya, terjadi peningkatan tajam dalam kapasitas pembekuan darah karena intensifikasi proses pembentukan trombin yang nyata sambil mempertahankan peningkatan koagulabilitas "struktural". Pada pasien dengan kehilangan darah masif, terjadi penurunan potensi pembekuan karena penurunan konsentrasi fibrinogen, aktivitas faktor XIII, dan jumlah trombosit. Pada tahap perawatan bedah pada pasien dengan bentuk terbatas tuberkulosis paru, gangguan signifikan dalam sistem homeostasis tidak terjadi. Pada pasien dengan proses yang tersebar luas, saat melakukan pneumonektomi atau pleuropneumonektomi, sindrom DIC sering berkembang, yang dapat berbentuk “penyakit kedua”.

Untuk memantau keadaan sistem pembekuan darah pada penderita tuberkulosis paru perlu dilakukan pemeriksaan waktu tromboplastin parsial teraktivasi (APTT), fibrinogen, waktu trombin, indeks protrombin, serta waktu perdarahan dan waktu pembekuan darah.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

Studi hormonal

Pengamatan klinis dan eksperimental modern menunjukkan adanya perubahan status hormonal pada peradangan tuberkulosis paru-paru tertentu. Telah terbukti bahwa koreksi disfungsi sistem hipofisis-adrenal, hipofisis-tiroid dan fungsi pankreas dalam kombinasi dengan terapi anti-tuberkulosis berkontribusi pada aktivasi fibrogenesis dan proses perbaikan pada fokus peradangan tertentu.

Keadaan fungsional sistem hipofisis-tiroid dinilai dari kandungan triiodotironin (T3), tiroksin (T4), dan hormon perangsang tiroid hipofisis (TSH) dalam serum darah _. Telah _ditetapkan bahwa hipotiroidisme subklinis terdeteksi pada 38-45% pasien dengan tuberkulosis paru, dan paling sering didiagnosis dalam bentuk proses yang disebarluaskan dan fibrosa-kavernosa. Dalam bentuk-bentuk ini, kadar T3 dan T4 berkurang paling tajam _, dan _{ketidakseimbangan} hormon-hormon ini terjadi dalam bentuk peningkatan rasio _T4/ T3.

Fungsi korteks adrenal dinilai berdasarkan kadar kortisol serum, dan fungsi endokrin pankreas dinilai berdasarkan konsentrasi insulin imunoreaktif. Pada fase akut penyakit infeksi, kebutuhan kortisol endogen dan insulin meningkat. Hiperinsulinemia juga menunjukkan resistensi insulin pada jaringan tubuh, yang merupakan ciri khas setiap proses inflamasi aktif, khususnya yang spesifik. Penentuan fungsi glukokortikoid kelenjar adrenal pada tuberkulosis paru aktif memungkinkan kita untuk mendeteksi adanya hiperkortisisme pada sebagian besar pasien. Konsentrasi kortisol darah normal pada pasien dengan peradangan infeksi pada periode akut harus dianggap sebagai insufisiensi relatif fungsi glukokortikoid korteks adrenal, yang dapat menjadi dasar untuk terapi penggantian dengan dosis glukokortikoid yang memadai.

Hampir sepertiga pasien tuberkulosis paru memiliki kadar insulinemia rendah yang mendekati batas bawah normal, sementara 13-20% memiliki hiperinsulinisme yang signifikan. Baik hipoinsulinisme relatif maupun hiperinsulinisme merupakan faktor risiko tinggi untuk perkembangan gangguan metabolisme karbohidrat dengan tingkat keparahan yang bervariasi. Perubahan dalam aktivitas fungsional sel-B pankreas ini memerlukan pemantauan glikemia secara teratur pada pasien tuberkulosis dan pencegahan diabetes melitus yang tepat waktu. Selain itu, hal ini berfungsi sebagai pembenaran tambahan untuk kesesuaian penggunaan dosis fisiologis insulin dalam terapi tuberkulosis yang kompleks.

Secara umum, penurunan kadar hormon tiroid, ketidakseimbangannya, hiperkortisolemia, dan hiperinsulinisme paling nyata pada pasien dengan proses tuberkulosis yang parah, dengan lesi paru yang luas dan gejala keracunan tuberkulosis yang nyata.

Diagnostik mikrobiologi tuberkulosis

Studi mikrobiologi diperlukan untuk mengidentifikasi pasien tuberkulosis, memverifikasi diagnosis, memantau dan mengoreksi kemoterapi, menilai hasil pengobatan, dengan kata lain, sejak pasien tuberkulosis didaftarkan hingga ia dihapus dari daftar.

Semua program dan proyek epidemiologi didasarkan pada penilaian jumlah ekskretor bakteri, yang tidak mungkin dilakukan tanpa menggunakan metode laboratorium untuk mendeteksi mikobakteri tuberkulosis. Ketika memeriksa daya tarik populasi yang disebut tidak terorganisir, persentase ekskretor bakteri mencapai 70 atau lebih, yang menjadikan metode laboratorium sebagai cara yang cukup efektif untuk mengidentifikasi pasien tuberkulosis di antara kelompok populasi ini.

Metode mikrobiologi tradisional untuk mendiagnosis tuberkulosis adalah studi bakterioskopi dan kultur. Metode modern meliputi kultur mikobakteri tuberkulosis dalam sistem otomatis dan PCR. Namun, semua metode ini tentu saja dikombinasikan dengan metode bakteriologi klasik.

Koleksi materi diagnostik

Efektivitas uji laboratorium sangat bergantung pada kualitas bahan diagnostik. Kepatuhan terhadap aturan pengumpulan, penyimpanan, dan pengangkutan bahan diagnostik serta penerapan algoritma pemeriksaan pasien yang tepat secara langsung memengaruhi hasil dan memastikan keamanan biologis.

Berbagai bahan digunakan untuk menguji tuberkulosis. Karena tuberkulosis paru merupakan bentuk infeksi tuberkulosis yang paling umum, bahan utama untuk pengujian dianggap sebagai dahak dan jenis lain dari sekret saluran trakeobronkial: sekret saluran pernapasan atas yang diperoleh setelah menghirup aerosol: air bilasan bronkial; bilasan bronkoalveolar; bahan yang diperoleh selama bronkoskopi, biopsi transtrakeal dan intrapulmonal: aspirasi bronkial, apusan laring, eksudat, apusan luka, dll.

Efektivitas penelitian meningkat jika pengumpulan bahan dari pasien dilakukan secara terkendali. Untuk tujuan ini, ruangan yang dilengkapi secara khusus dialokasikan atau bilik khusus dibeli. Pengumpulan bahan merupakan prosedur yang berbahaya, oleh karena itu, bahan untuk penelitian harus dikumpulkan sesuai dengan aturan keselamatan infeksi.

Bahan untuk pengujian Mycobacterium tuberculosis dikumpulkan dalam botol steril dengan tutup yang disekrup rapat untuk mencegah kontaminasi lingkungan dan melindungi bahan yang dikumpulkan dari kontaminasi.

Botol untuk mengumpulkan bahan diagnostik harus memenuhi persyaratan berikut:

• harus terbuat dari bahan yang tahan benturan;
• harus mencair dengan mudah ketika diautoklaf;
• memiliki volume yang cukup (40-50 ml):
• memiliki bukaan yang lebar untuk menampung dahak (diameter tidak kurang dari 30 mm);
• mudah ditangani, transparan atau tembus cahaya, sehingga kuantitas dan kualitas sampel yang dikumpulkan dapat dinilai tanpa membuka tutupnya.

Untuk memperoleh hasil penelitian yang optimal, syarat-syarat berikut harus dipenuhi:

• pengumpulan bahan harus dilakukan sebelum dimulainya kemoterapi;
• bahan untuk penelitian harus dikumpulkan sebelum makan atau minum obat di pagi hari;
• Untuk penelitian ini, sebaiknya dilakukan pengambilan sampel dahak pagi hari minimal 3 kali. Pengambilan dahak dilakukan selama 3 hari berturut-turut;
• Bahan yang dikumpulkan harus dikirim ke laboratorium secepat mungkin:
• dalam kasus di mana tidak mungkin untuk segera mengirim bahan ke laboratorium, bahan tersebut disimpan dalam lemari es pada suhu udara 4 °C selama tidak lebih dari 48 jam;
• Saat mengangkut material, perlu memberi perhatian khusus pada integritas botol.

Dahak yang dikumpulkan dengan benar memiliki karakter mukus atau mukopurulen. Volume optimal dari bagian dahak yang diperiksa adalah 3-5 ml.

Pengambilan dahak dilakukan di bawah pengawasan petugas kesehatan. Petugas yang bertanggung jawab untuk mengambil dahak harus memastikan bahwa aturan-aturan tertentu dipatuhi:

• Perlu dijelaskan kepada pasien tujuan pemeriksaan dan perlunya batuk bukan air liur atau lendir nasofaring, tetapi isi bagian dalam saluran pernapasan. Ini dapat dicapai sebagai hasil dari batuk produktif yang terjadi setelah beberapa (2-3) napas dalam. Perlu juga untuk memperingatkan pasien bahwa ia harus terlebih dahulu berkumur dengan air matang untuk menghilangkan bagian utama mikroflora yang tumbuh di rongga mulut dan sisa makanan yang mempersulit pemeriksaan dahak;
• Petugas medis yang terlibat dalam pengumpulan dahak, selain mengenakan gaun dan topi, harus mengenakan masker, sarung tangan karet, dan celemek karet;
• berdiri di belakang pasien, dianjurkan untuk memegang botol sedekat mungkin dengan bibirnya dan segera mengeluarkan dahak ke dalamnya saat batuk, sementara perlu dipastikan bahwa aliran udara diarahkan menjauh dari petugas kesehatan:
• Setelah pengambilan dahak selesai, petugas kesehatan harus menutup botol dengan hati-hati beserta tutupnya dan menilai jumlah dan kualitas dahak yang terkumpul. Botol kemudian diberi label dan ditempatkan dalam kotak khusus untuk dibawa ke laboratorium.

Jika pasien tidak mengeluarkan dahak, maka pada malam sebelum dan pagi hari pada hari pengambilan bahan, pasien harus diberi ekspektoran: ekstrak akar marshmallow (mucaltin), bromhexine, ambroxol, dll. - atau inhalasi yang mengiritasi harus digunakan, menggunakan peralatan yang dipasang di ruangan untuk mengumpulkan dahak. Bahan yang dikumpulkan dengan cara ini tidak dapat diawetkan dan harus diperiksa pada hari pengambilan. Untuk menghindari "penolakan" di laboratorium, catatan khusus harus dibuat dalam rujukan.

Jika studi mikrobiologi tidak dilakukan di institusi tertentu, bahan diagnostik yang dikumpulkan harus dikirim ke laboratorium secara terpusat, dengan ketentuan bahwa bahan tersebut disimpan di lemari es atau dengan bahan pengawet di antara pengiriman. Bahan tersebut dikirim ke laboratorium dalam kotak transportasi yang dapat dengan mudah didisinfeksi. Setiap sampel harus diberi label yang sesuai, dan seluruh batch harus disertai dengan formulir yang lengkap.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

Cara dan Frekuensi Pemeriksaan Pasien

Selama pemeriksaan awal, yang disebut diagnostik, seorang pasien untuk tuberkulosis, perlu untuk memeriksa setidaknya 3 bagian dahak yang dikumpulkan di bawah pengawasan tenaga medis selama 2 atau 3 hari, yang meningkatkan efektivitas mikroskopi.

Skrining primer untuk tuberkulosis harus dilakukan oleh semua institusi medis dan diagnostik dalam sistem perawatan kesehatan. Baru-baru ini, untuk meningkatkan efektivitas pemeriksaan primer, apa yang disebut pusat mikroskopi telah diselenggarakan berdasarkan laboratorium diagnostik klinis, dilengkapi dengan mikroskop dan peralatan modern untuk memastikan keamanan epidemi.

Lembaga antituberkulosis menggunakan skema survei yang menyediakan pemeriksaan dahak atau bahan diagnostik lainnya minimal 3 kali dalam waktu 3 hari. Selama perawatan, pemeriksaan mikrobiologi dilakukan secara rutin minimal sebulan sekali pada fase kemoterapi intensif. Saat beralih ke fase tindak lanjut, pemeriksaan dilakukan lebih jarang - dengan interval 2-3 bulan, sedangkan frekuensi pemeriksaan dikurangi menjadi dua kali.

Fitur pengumpulan bahan diagnostik untuk tuberkulosis ekstra paru

Ciri bahan patologis pada bentuk tuberkulosis ekstra paru adalah rendahnya konsentrasi mikobakteri tuberkulosis di dalamnya, sehingga memerlukan metode penelitian mikrobiologi yang lebih sensitif, terutama metode penaburan pada media nutrisi.

Dalam kasus tuberkulosis genitourinari, urin merupakan bahan yang paling mudah diakses untuk pemeriksaan. Pengambilan urin harus dilakukan oleh perawat yang terlatih khusus.

Genital bagian luar dicuci dengan air dan sabun atau larutan kalium permanganat yang lemah. Lubang uretra bagian luar dirawat dengan hati-hati. Bagian tengah urin pagi dikumpulkan dalam botol steril: pada pria - secara alami, pada wanita - menggunakan kateter. Urin dari pelvis ginjal dikumpulkan dalam tabung reaksi steril selama kateterisasi satu atau dua ginjal, dalam kasus terakhir - tentu saja terpisah dari masing-masing ginjal. Sejumlah kecil urin ini disentrifugasi, endapannya diperiksa.

Pada pria, sperma, tusukan testis, dan sekresi prostat disentrifugasi untuk mendapatkan endapan. Dengan lokalisasi proses tertentu di area genital pada pria, pijat prostat dapat meningkatkan pelepasan sekresi yang mengandung mikobakteri tuberkulosis.

Darah menstruasi diambil dari wanita dengan cara dihisap atau menggunakan tutup Kafka. Material yang dihasilkan dilepaskan dari eritrosit dengan cara mencucinya menggunakan air suling dan kemudian disentrifugasi. Endapannya diperiksa.

Keluarnya cairan dari saluran serviks rahim ditampung dalam suatu wadah atau tutup Kafka, yaitu sebaiknya terkumpul 1-2 ml bahan patologis.

Bahan yang diperoleh selama intervensi bedah pada ginjal, alat kelamin, biopsi, kerokan endometrium, dihomogenkan. Untuk melakukan ini, bahan tersebut ditempatkan dalam mortar steril dan dihancurkan secara menyeluruh dengan gunting steril. Pasir sungai steril ditambahkan ke suspensi yang dihasilkan dalam jumlah yang sama dengan massanya, kemudian 0,5-1,0 ml larutan natrium klorida isotonik ditambahkan dan semuanya digiling sampai terbentuk massa lembek dengan penambahan larutan natrium klorida isotonik (4-5 ml). Kemudian massa dibiarkan mengendap selama 1-1,5 menit, supernatan diperiksa.

Tuberkulosis tulang dan sendi. Tusukan (nanah dari abses) yang diperoleh dengan spuit steril ditempatkan dalam wadah steril dan segera dikirim ke laboratorium. Dengan menggunakan pipet steril, yang sebelumnya dibasahi dengan larutan natrium klorida isotonik steril, 2-5 ml nanah diambil, dipindahkan ke botol dengan manik-manik dan ditambahkan 2-3 ml larutan natrium klorida isotonik lainnya. Botol ditutup dengan sumbat dan dikocok dalam pengocok selama 8-10 menit. Suspensi yang dihomogenkan diperiksa.

Pada tuberkulosis osteoartikular bentuk fistula, nanah diambil dari fistula. Cairan yang keluar banyak langsung dikumpulkan ke dalam tabung reaksi. Pada kasus cairan yang keluar sedikit, saluran fistula dicuci dengan larutan natrium klorida isotonik steril, dan cairan yang terkumpul dalam tabung reaksi atau sepotong tampon yang dibasahi nanah dikirim untuk diperiksa.

Bahan bedah yang diperoleh selama intervensi bedah pada tulang dan sendi dapat berupa massa purulen-nekrotik, granulasi, jaringan parut, jaringan tulang, jaringan membran sinovial, dan substrat lainnya. Pengolahannya dilakukan seperti pada kasus tuberkulosis ginjal.

Pemeriksaan mikrobiologis cairan sinovial dalam larutan natrium sitrat 3% (dengan perbandingan 1:1) untuk mencegah pembekuan dilakukan segera setelah tusukan.

Tuberkulosis kelenjar getah bening. Nanah yang dikeluarkan selama tusukan kelenjar getah bening diperiksa dengan cara yang sama seperti nanah dari abses. Jaringan kelenjar getah bening yang diperoleh selama intervensi bedah dan biopsi diperiksa seperti pada bentuk tuberkulosis lainnya.

Pemeriksaan feses untuk Mycobacterium tuberculosis sangat jarang dilakukan karena hampir tidak adanya hasil positif.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

Mikroskopi mikobakteri

Mikroskopi sputum merupakan metode yang relatif cepat, sederhana, dan murah yang harus digunakan dalam semua kasus yang diduga tuberkulosis. Selain itu, penelitian ini dilakukan untuk menilai efektivitas kemoterapi dan untuk memastikan pemulihan atau kegagalan pengobatan jika tidak ada hasil kultur.

Ada dua metode pemeriksaan mikroskopis yang digunakan:

• metode mikroskopi langsung, ketika apusan disiapkan langsung dari bahan diagnostik;
• metode mikroskopi sedimen yang disiapkan dari bahan yang diolah dengan dekontaminan untuk penelitian kultur.

Metode pertama digunakan di laboratorium di mana hanya dilakukan penelitian mikroskopis (laboratorium diagnostik klinis jaringan medis umum).

Hasil terbaik pemeriksaan mikroskopis diperoleh dengan memusatkan bahan diagnostik (misalnya dengan sentrifugasi).

Untuk mendeteksi Mycobacterium tuberculosis dengan probabilitas 50% melalui mikroskopi, 1 ml dahak harus mengandung lebih dari 5.000 sel mikroba. Dahak dari pasien dengan bentuk tuberkulosis paru biasanya mengandung sejumlah besar bakteri tahan asam, yang memungkinkannya dideteksi secara andal melalui bakterioskopi. Sensitivitas diagnostik metode ini dapat ditingkatkan dengan memeriksa beberapa sampel dahak dari satu pasien. Hasil pemeriksaan bakterioskopi negatif tidak menyingkirkan diagnosis tuberkulosis, karena dahak beberapa pasien mengandung lebih sedikit Mycobacterium daripada yang dapat dideteksi melalui mikroskopi. Persiapan apusan dahak yang buruk juga dapat menjadi penyebab hasil pemeriksaan bakterioskopi negatif.

Metode yang paling umum untuk mendeteksi mikobakteri tahan asam dalam apusan adalah pewarnaan Ziehl-Neelsen. Metode ini didasarkan pada penetrasi karbol fuchsin ke dalam sel mikroba melalui membran yang meliputi lapisan lilin-lipid, dengan efek pemanasan dan aksi etsa fenol yang kuat secara bersamaan. Dekolorisasi apusan berikutnya dengan larutan asam sulfat 25% atau alkohol klorida 3% menyebabkan dekolorisasi semua struktur yang tidak tahan asam. Elemen apusan yang didekolorisasi diwarnai dengan larutan metilen biru 0,3%. Mikobakteri tidak mengenali pewarna anilin konvensional, akibatnya mikobakteri tahan asam diwarnai merah rasberi, dan mikroba dan elemen seluler lainnya diwarnai biru.

Untuk memeriksa apusan yang diwarnai menurut Ziehl-Neelsen, gunakan mikroskop binokuler cahaya dengan lensa objektif imersi (perbesaran 90 atau 100 kali lipat) dan lensa okuler dengan perbesaran 7 atau 10 kali lipat. Sebanyak 100 bidang pandang diperiksa, yang cukup untuk mendeteksi satu mikobakteri dalam apusan. Jika hasil pemeriksaan tersebut negatif, disarankan untuk memeriksa 200 bidang pandang lagi untuk konfirmasi. Hasilnya dicatat, yang menunjukkan jumlah mikobakteri tahan asam (AFB) yang terdeteksi.

Selain metode ini, pewarnaan fluorokrom digunakan untuk mikroskopi luminescent, yang memungkinkan pencapaian hasil terbaik. Penggunaan metode ini meningkatkan efisiensi mikroskopi hingga 10-15%. Ketika mikobakteri diobati dengan pewarna luminescent (auramin, rhodamin, dll.), zat-zat ini juga mengikat struktur seperti lilin dari sel mikroba. Ketika sel-sel yang diwarnai diiradiasi dengan sumber cahaya yang menarik (spektrum radiasi ultraviolet tertentu), mereka mulai bersinar oranye atau merah terang dengan latar belakang hitam atau hijau tua. Karena kecerahan dan kontras yang tinggi dari gambar yang terlihat, perbesaran keseluruhan mikroskop dapat dikurangi hingga 4-10 kali, yang memperluas bidang pandang dan mengurangi waktu melihat sediaan. Bersamaan dengan ini, karena kedalaman bidang yang jauh lebih besar, kenyamanan penelitian dapat ditingkatkan.

Bila menggunakan mikroskop fluoresensi, pengamatan area yang sama pada apusan membutuhkan waktu yang jauh lebih sedikit daripada mikroskop cahaya pada apusan yang diwarnai menurut Ziehl-Neelsen. Jika seorang ahli mikroskop mengamati sekitar 20-25 apusan tersebut selama satu hari kerja, maka dengan bantuan mikroskop fluoresensi ia dapat memeriksa lebih dari 60-80 sampel dalam waktu yang sama. Ahli mikroskop yang berpengalaman mengetahui bahwa pewarnaan sel dengan campuran auramin dan rhodamin dalam beberapa hal khusus untuk mikobakteri tahan asam, yang dalam kasus ini memiliki tampilan batang berwarna emas. Saprofit diwarnai kehijauan.

Keuntungan penting lain dari metode mikroskopi fluoresensi adalah kemampuan untuk mendeteksi mikobakteri yang berubah yang telah kehilangan sifat tahan asamnya di bawah pengaruh sejumlah faktor yang tidak menguntungkan, khususnya kemoterapi intensif, dan karena itu tidak terdeteksi oleh pewarnaan Ziehl-Neelsen.

Kerugian dari metode mikroskopi fluoresensi meliputi biaya mikroskop dan pengoperasiannya yang relatif tinggi. Namun, di laboratorium terpusat atau laboratorium besar lainnya, di mana beban kerja melebihi norma tiga teknisi laboratorium yang bekerja dengan tiga mikroskop konvensional, lebih murah untuk menggunakan satu mikroskop fluoresensi saja.

Metode bakterioskopik memiliki spesifitas yang cukup tinggi (89-100%). Sekitar 97% hasil positif yang diperoleh dengan metode mikroskopi apa pun dikonfirmasi dengan jelas oleh hasil penyemaian.

Perlu dicatat bahwa pemeriksaan mikroskopis dari apusan bahan patologis tidak memungkinkan seseorang untuk menentukan spesies mikobakteri tahan asam yang terdeteksi. Metode mikroskopis memungkinkan seseorang untuk menarik kesimpulan hanya tentang ada atau tidaknya mikroorganisme tahan asam dalam sediaan, yang dijelaskan oleh keberadaan sejumlah besar mikroorganisme tahan asam non-tuberkulosis yang secara morfologis mirip dengan mikobakteri kompleks tuberkulosis.

Evaluasi hasil mikroskopi dilakukan dalam satuan semi-kuantitatif.

Agar dapat membandingkan hasil dari berbagai metode mikroskopi, koefisien empiris diperkenalkan. Misalnya, untuk membandingkan hasil apusan yang diwarnai dengan pewarna fluoresen dengan data studi mikroskopi cahaya (perbesaran 1000 kali lipat), perlu membagi jumlah mikobakteri tahan asam yang terdeteksi menggunakan mikroskop fluoresen dengan koefisien yang sesuai: pada perbesaran mikroskop 250 kali lipat - dengan 10, pada perbesaran 450 kali lipat - dengan 4, pada perbesaran 630 kali lipat - dengan 2.

Fitur mikroskopi pada tuberkulosis ekstra paru

Mikroskopi langsung dilakukan, serta mikroskopi apusan yang disiapkan setelah pengayaan dengan pewarnaan berikutnya menurut Ziehl-Neelsen atau pewarna fluoresen. Mikroskopi langsung apusan tidak efektif karena konsentrasi mikobakteri yang rendah dalam bahan, dan oleh karena itu lebih rasional untuk menggunakan metode pengayaan. Sentrifugasi adalah yang paling efektif. Jika bahan biologis kental, sentrifugasi dengan homogenisasi dan pencairan bahan secara bersamaan digunakan, yang dilakukan dengan menggunakan sentrifus berkecepatan tinggi dengan gaya sentrifugasi 3000 g dan larutan hipoklorit. Metode pengayaan lainnya, seperti mikroflotasi, saat ini tidak digunakan karena pembentukan aerosol yang berbahaya secara biologis.

[ 37 ]

Metode kultur untuk mendiagnosis tuberkulosis

Metode penyemaian, atau metode kultur, lebih sensitif daripada mikroskopi apusan dan memiliki sejumlah keunggulan dibandingkan yang terakhir. Metode ini memungkinkan pendeteksian beberapa lusin mikobakteri yang hidup dalam bahan yang diperiksa dan memiliki nilai diagnostik yang tinggi. Hal ini terutama penting saat memeriksa bahan dari pasien yang baru didiagnosis atau dirawat yang mengeluarkan sejumlah kecil mikobakteri.

Dibandingkan dengan mikroskopi, penelitian kultur memungkinkan peningkatan jumlah pasien tuberkulosis yang terdeteksi hingga lebih dari 15-25%, serta untuk memverifikasi tuberkulosis pada tahap awal, saat penyakit tersebut masih dapat diobati dengan mudah. Keuntungan yang sangat penting dari penelitian kultur dianggap sebagai kemungkinan untuk memperoleh kultur patogen, yang dapat diidentifikasi dan dipelajari terkait dengan sensitivitas obat, virulensi, dan sifat biologis lainnya.

Kerugian metode budidaya antara lain durasinya (masa tunggu bahan mencapai 10 minggu), biaya lebih tinggi, dan kompleksitas pengolahan bahan diagnostik.

Prinsip perlakuan pra-tabur bahan diagnostik

Metode mikrobiologi konvensional tidak dapat digunakan untuk melakukan tes tuberkulosis. Hal ini disebabkan oleh fakta bahwa mikobakteri tuberkulosis tumbuh sangat lambat, dan sebagian besar sampel klinis mengandung mikroorganisme dan jamur piogenik dan pembusuk yang tumbuh cepat. Pertumbuhannya yang cepat pada media nutrisi yang kaya mengganggu perkembangan mikobakteri dan tidak memungkinkan patogen tuberkulosis diisolasi, sehingga bahan diagnostik harus diolah terlebih dahulu sebelum disemai. Selain itu, mikobakteri yang dilepaskan dari saluran pernapasan pasien biasanya dikelilingi oleh sejumlah besar lendir, yang membuatnya sulit untuk dikonsentrasikan. Dalam hal ini, sebelum menabur dahak dan bahan serupa lainnya, bahan tersebut harus dicairkan dan didekontaminasi.

Semua deterjen dan dekontaminan memiliki efek toksik yang lebih atau kurang jelas pada mikobakteri. Sebagai hasil dari perawatan, hingga 90% mikobakteri dapat mati. Untuk mempertahankan sebagian populasi mikobakteri yang cukup, perlu menggunakan metode perawatan yang lembut yang memungkinkan, di satu sisi, untuk menekan mikroorganisme piogenik dan pembusuk yang tumbuh cepat, dan di sisi lain, untuk mempertahankan viabilitas mikobakteri yang ada dalam bahan secara maksimal.

Bergantung pada bahan, homogenitas dan tingkat kontaminasi, berbagai dekontaminan digunakan untuk perawatan pra-penyemaian: untuk dahak - larutan natrium hidroksida 4%, larutan trisodium fosfat 10%, benzalkonium klorida trisodium fosfat, NALC-NaOH (N-asetil-L-sistein-natrium hidroksida) dengan konsentrasi NaOH akhir 1%, untuk urin dan bahan cair lainnya - larutan asam sulfat 3%, untuk sampel yang terkontaminasi, bahan yang mengandung lemak - larutan asam oksalat hingga 5%. Selain itu, dalam beberapa kasus, enzim dan surfaktan (deterjen) digunakan. Penggunaan Tween dan beberapa deterjen lainnya disertai dengan kematian sel mikobakteri yang lebih sedikit (40-50% bertahan hidup). Namun, mereka hanya dapat digunakan untuk bahan cair. NALC-NaOH, yang diproduksi dalam kit, adalah yang paling banyak digunakan di dunia. Metode ini memungkinkan untuk mengisolasi lebih dari 85% populasi sel mikobakteri. Dekontaminasi bahan padat yang mengandung jaringan lebih sulit, karena sulit untuk memperkirakan tingkat penyebaran bahan selama homogenisasi. Misalnya, pemrosesan biopsi kelenjar getah bening sering kali disertai dengan peningkatan frekuensi kontaminasi dengan flora asing. Dalam hal ini, etonium 1% dapat digunakan.

Material yang tidak homogen dihomogenkan menggunakan manik-manik kaca dengan adanya dekontaminan. Material cair disentrifugasi terlebih dahulu dan hanya endapannya saja yang diproses.

Teknik Penyemaian dan Inkubasi

Setelah proses awal, bahan tersebut disentrifugasi, yang mengendapkan mikobakteri dan meningkatkan kandungannya dalam sedimen ("pengayaan sedimen"). Sedimen yang dihasilkan dinetralkan dan diinokulasi ke permukaan media nutrisi padat atau tabung reaksi dengan media cair (semi-cair). Apusan untuk pemeriksaan mikroskopis disiapkan dari sedimen yang tersisa. Teknik penyemaian harus mencegah kontaminasi silang dari bahan diagnostik.

Untuk interpretasi klinis yang andal dari hasil penelitian mikrobiologi, aturan berikut harus diperhatikan: studi mikroskopis dan kultural harus dilakukan secara paralel dari sampel bahan diagnostik yang sama.

Tabung yang telah diinokulasi ditempatkan dalam termostat pada suhu 37 ^o C selama 2 hari dalam posisi horizontal. Hal ini memastikan penyerapan bahan yang lebih merata ke dalam media nutrisi. Setelah 2 hari, tabung dipindahkan ke posisi vertikal dan ditutup rapat dengan sumbat karet atau silikon untuk mencegah media yang disemai mengering.

Tanaman disimpan dalam termostat pada suhu 37 ^° C selama 10-12 minggu dengan pemeriksaan mingguan secara teratur. Parameter berikut dicatat pada setiap pemeriksaan kontrol:

• periode pertumbuhan yang dapat diamati secara visual sejak hari penanaman;
• tingkat pertumbuhan (jumlah CFU);
• kontaminasi kultur dengan flora mikroba atau jamur asing (tabung reaksi tersebut dihilangkan);
• tidak ada pertumbuhan yang terlihat. Tabung dibiarkan di termostat sampai pemeriksaan berikutnya.

Media nutrisi

Berbagai media nutrisi digunakan untuk membudidayakan mikobakteri: padat, semi-cair, cair. Namun, tidak ada media nutrisi yang diketahui memiliki sifat yang menjamin pertumbuhan semua sel mikobakteri. Dalam hal ini, untuk meningkatkan efisiensi, disarankan untuk menggunakan 2-3 media nutrisi dengan komposisi berbeda secara bersamaan.

Sebagai media standar untuk isolasi primer patogen tuberkulosis dan penentuan sensitivitas obatnya, WHO merekomendasikan media Lowenstein-Jensen. Ini adalah media telur padat tempat pertumbuhan mikobakteri diperoleh pada hari ke-20-25 setelah menabur bahan yang positif secara bakterioskopik. Menabur bahan yang negatif secara bakterioskopik memerlukan masa inkubasi yang lebih lama (hingga 10-12 minggu).

Di negara kita, medium telur Finn-II yang diusulkan oleh ER Finn telah tersebar luas. Bedanya, medium ini menggunakan natrium glutamat, yang memicu jalur lain untuk sintesis asam amino dalam mikobakteri, alih-alih L-asparagine. Pertumbuhan muncul pada medium ini agak lebih awal, dan frekuensi isolasi mikobakteri 6-8% lebih tinggi daripada pada medium Lowenstein-Jensen.

Untuk meningkatkan efisiensi diagnostik bakteriologis tuberkulosis ekstra paru, disarankan untuk memasukkan media Finn-II yang dimodifikasi ke dalam kompleks media nutrisi. Untuk mempercepat pertumbuhan, 0,05% natrium tioglikolat juga dimasukkan ke dalam media nutrisi Finn-II, yang mengurangi konsentrasi oksigen. Untuk melindungi sistem enzim mikobakteri dari produk toksik peroksidasi lipid, antioksidan α-tokoferol asetat dimasukkan ke dalam media nutrisi Finn-II pada konsentrasi 0,001 μg/ml. Bahan diagnostik disemai menggunakan metode standar.

Di laboratorium anti-tuberkulosis di Rusia, modifikasi lain dari media nutrisi padat juga digunakan: media nutrisi "Novaya" yang diusulkan oleh GG Mordovsky, media nutrisi A-6 dan A-9 yang dikembangkan oleh VA Anikin, dll.

Karena kenyataan bahwa selama kemoterapi, kerusakan terjadi pada berbagai sistem metabolisme sel mikroba, sebagian populasi mikobakteri kehilangan kemampuan untuk berkembang secara normal pada media nutrisi konvensional dan membutuhkan media nutrisi yang seimbang secara osmotik (semi-cair atau cair).

Evaluasi dan pencatatan hasil kultur material diagnostik

Beberapa strain dan jenis mikobakteri tumbuh lambat, pertumbuhan mungkin muncul bahkan pada hari ke-90. Jumlah kultur tersebut sedikit, tetapi ini memaksa penaburan untuk disimpan dalam termostat selama 2,5-3 bulan.

Kultur Mycobacterium tuberculosis yang virulen biasanya tumbuh pada media telur padat sebagai koloni bentuk-R dengan ukuran dan tampilan yang bervariasi. Koloni-koloni tersebut kering, berkerut, berwarna gading, dan sedikit berpigmen. Pada media lain, koloni Mycobacterium tuberculosis mungkin lebih lembap. Setelah menjalani kemoterapi atau selama pengobatan, koloni halus dengan pertumbuhan lembap (bentuk-S) dapat diisolasi.

Saat mengisolasi kultur, serangkaian studi khusus digunakan untuk membedakan mikobakteri tuberkulosis dari mikobakteri non-tuberkulosis dan saprofit tahan asam.

Jawaban positif diberikan setelah pemeriksaan mikroskopis wajib dari apusan dari koloni yang tumbuh yang diwarnai menurut Ziehl-Neelsen. Dalam kasus pertumbuhan mikobakteri, batang merah terang ditemukan dalam apusan, terletak sendiri-sendiri atau berkelompok, membentuk kelompok dalam bentuk kain kempa atau anyaman. Dalam kultur muda, terutama yang diisolasi dari pasien yang dirawat dengan kemoterapi untuk waktu yang lama, mikobakteri dibedakan oleh polimorfisme yang jelas, hingga adanya varian pendek, hampir berbentuk kokoid atau memanjang yang menyerupai miselium jamur, bersama dengan bentuk berbentuk batang.

Intensitas pertumbuhan mikobakteri ditetapkan menurut skema berikut: (+) - 1-20 CFU dalam tabung reaksi (ekskresi bakteri rendah); (++) - 20-100 CFU dalam tabung reaksi (ekskresi bakteri sedang); (+++) - >100 CFU dalam tabung reaksi (ekskresi bakteri melimpah). Dalam diagnostik laboratorium tuberkulosis, tidak cukup hanya memberikan jawaban yang menunjukkan apakah mikobakteri telah terdeteksi dengan metode tertentu atau tidak. Penting juga untuk memiliki gagasan terperinci tentang volume dan sifat populasi mikobakteri, komposisi dan sifat-sifatnya. Data inilah yang memungkinkan seseorang untuk menafsirkan keadaan proses dengan benar, merencanakan taktik, dan segera menyesuaikan pengobatan.

Dalam beberapa tahun terakhir, media nutrisi berbasis agar dengan berbagai aditif pertumbuhan dan penggunaan campuran gas khusus telah diusulkan untuk mempercepat pertumbuhan mikobakteri. Untuk memperoleh pertumbuhan mikobakteri pada media ini, atmosfer dengan kandungan karbon dioksida yang meningkat (4-7%) dibuat selama pembudidayaan. Untuk tujuan ini, inkubator CO2 khusus digunakan _. Namun, sistem pembudidayaan mikobakteri otomatis telah menerima pengembangan terbesar: MGIT-BACTEC-960 dan MB/Bact.

Salah satu sistem tersebut adalah sistem MGIT (mycobacteria growth indication tube), yang merupakan pengembangan teknologi tinggi dan dirancang untuk mempercepat diagnostik bakteriologis tuberkulosis dan penentuan sensitivitas mikobakteri terhadap obat lini pertama dan beberapa obat lini kedua. MGIT dirancang untuk digunakan sebagai bagian dari perangkat VASTEC-960. Mikroorganisme dibudidayakan dalam tabung reaksi khusus dengan media nutrisi cair berdasarkan media Middlebrook-7H9 yang dimodifikasi. Untuk merangsang pertumbuhan mikobakteri dan menekan pertumbuhan mikroflora asing, Suplemen Pertumbuhan MGIT dan campuran obat antibakteri PANTA digunakan.

Pertumbuhan mikroorganisme dicatat secara optik. Hal ini didasarkan pada fluoresensi, yang terjadi ketika mikobakteri mengonsumsi oksigen selama pertumbuhannya. Pewarna fluorokrom yang bergantung pada oksigen terkandung di bagian bawah tabung reaksi khusus dan ditutupi dengan lapisan silikon. Reproduksi mikobakteri menyebabkan penurunan jumlah oksigen dalam tabung reaksi dan penurunan konsentrasinya, yang menyebabkan peningkatan fluoresensi, yang menjadi terlihat ketika tabung reaksi disinari dengan sinar ultraviolet dan secara otomatis dicatat oleh fotosensor yang terpasang pada perangkat VASTES-960. Intensitas pendaran cahaya dicatat dalam satuan pertumbuhan (GU). Data pertumbuhan secara otomatis dimasukkan ke dalam komputer, tempat data tersebut dapat disimpan. Analisis komputer terhadap kurva pertumbuhan dapat memberikan informasi tentang keberadaan berbagai kelompok mikobakteri, termasuk yang tidak tuberkulosis, dan juga membantu mengevaluasi sifat pertumbuhan mikobakteri.

Sebagai hasil dari pengenalan sistem tersebut, waktu pertumbuhan mikobakteri telah berkurang secara signifikan, rata-rata 11 hari pada VASTEC-960 dan 19 hari pada MB/Bact dibandingkan 33 hari pada media nutrisi padat standar. Perlu dicatat bahwa sistem ini memerlukan personel yang berkualifikasi tinggi. Penaburan bahan pada media cair tentu saja disertai dengan penaburan pada media Lowenstein-Jensen, yang berperan sebagai cadangan dalam kasus di mana mikobakteri tuberkulosis tidak tumbuh pada media lain.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

Penentuan kerentanan obat mikobakteri

Penentuan spektrum dan derajat sensitivitas mikobakteri terhadap obat antituberkulosis sangat penting secara klinis, serta untuk penilaian epidemiologis penyebaran tuberkulosis yang resistan terhadap obat. Selain itu, pemantauan resistensi obat memungkinkan kita untuk menilai efektivitas program antituberkulosis secara keseluruhan, menjadi indikator integral dari kerja semua komponen tindakan antituberkulosis.

Frekuensi dan waktu pengujian kerentanan obat:

• sebelum memulai pengobatan, sekali untuk menentukan strategi dan taktik pengobatan:
• Saat mengisolasi kultur dari berbagai bahan dari pasien (dahak, BAL, urin, eksudat, cairan serebrospinal, dll.), semua strain yang diisolasi diperiksa:
• pada akhir fase intensif pengobatan tanpa adanya dinamika klinis dan radiologis:
• jika perlu mengubah rejimen pengobatan dalam kasus:
  • tidak adanya negatifitas sputum;
  • kultur ulang setelah sputum negatif;
  • peningkatan tajam jumlah AFB dalam apusan setelah penurunan awal. Diketahui bahwa galur Mycobacterium tuberculosis dengan sensitivitas obat yang berbeda diisolasi dari bahan dari pasien tuberkulosis. Sensitivitas galur terhadap obat antituberkulosis dapat berbeda dalam spektrum obat, derajat, frekuensi, dan kecepatan perkembangan resistensi.

Derajat resistensi obat terhadap Mycobacterium tuberculosis ditentukan berdasarkan kriteria yang telah ditetapkan, yang difokuskan pada signifikansi klinis resistensi dan bergantung pada aktivitas anti-tuberkulosis obat, farmakokinetiknya, konsentrasi dalam lesi, dosis terapeutik maksimum, dan lain-lain.

Penentuan kerentanan obat terhadap mikobakteri saat ini dilakukan dengan menggunakan metode mikrobiologi:

• konsentrasi absolut (metode pengenceran pada media nutrisi padat atau cair),
• proporsi,
• koefisien resistansi.

Biasanya, resistensi ditunjukkan dalam bentuk pertumbuhan koloni mikobakteri tuberkulosis yang diamati secara visual, namun, ada metode yang menginduksi pertumbuhan pada tahap awal pembelahan sel mikobakteri dalam bentuk reaksi warna. Metode ini mengurangi waktu pengujian dari 3-4 menjadi 2 minggu.

Metode konsentrasi absolut yang direkomendasikan oleh Komite Kemoterapi WHO telah tersebar luas di Rusia sebagai metode terpadu. Dari sudut pandang metodologi, metode ini adalah yang paling sederhana, tetapi memerlukan standarisasi dan ketepatan prosedur laboratorium yang tinggi. Uji kerentanan obat terdiri dari satu set tabung reaksi dengan media nutrisi yang dimodifikasi dengan obat anti-tuberkulosis. Set tersebut terdiri dari 2-3 tabung reaksi dengan konsentrasi yang berbeda dari masing-masing obat yang digunakan, satu tabung reaksi kontrol dengan media tanpa obat, dan satu tabung reaksi yang berisi 1000 μg/ml natrium salisilat atau 500 μg/ml asam paranitrobenzoat untuk mendeteksi pertumbuhan mikobakteri non-tuberkulosis.

Untuk menyiapkan seperangkat media dengan preparat, gunakan media Lowenstein-Jensen yang dimodifikasi (tanpa pati), yang dituangkan ke dalam labu. Volume tertentu dari pengenceran obat anti-tuberkulosis yang sesuai ditambahkan ke masing-masing labu. Isi labu dicampur secara menyeluruh, dituangkan ke dalam tabung reaksi dan dikoagulasi dalam posisi miring selama 40 menit pada suhu 85 ° C. Disarankan untuk mengkoagulasi media dalam koagulator listrik dengan kontrol suhu otomatis. Media dengan obat anti-tuberkulosis

Baris pertama dapat disimpan dalam lemari es pada suhu 2-4 °C selama 1 bulan, sedangkan obat baris kedua - tidak lebih dari 2 minggu. Penyimpanan media dengan obat pada suhu ruangan tidak dapat diterima. Saat menyiapkan larutan obat anti-tuberkulosis, aktivitasnya diperhitungkan, menghitung konsentrasi dengan penyesuaian berat molekul bagian obat yang tidak spesifik, kemurnian, dll. Untuk menentukan sensitivitas obat, hanya zat yang murni secara kimia yang digunakan.

Prinsip metode ini adalah menentukan konsentrasi obat antituberkulosis yang dapat menekan pertumbuhan sebagian besar populasi mikobakteri. Jika dilakukan dengan benar, metode ini memiliki keandalan yang baik.

Sebelum melakukan pengujian, perlu dipastikan bahwa kultur Mycobacterium tuberculosis yang diisolasi tidak mengandung mikroflora asing. Suspensi homogen yang mengandung 500 juta badan mikroba dalam 1 ml (standar kekeruhan optik 5 unit) disiapkan dari kultur mikobakteri dalam larutan natrium klorida 0,9%. Suspensi yang dihasilkan diencerkan dengan larutan natrium klorida 0,9% (1:10) dan 0,2 ml suspensi ditambahkan ke setiap tabung reaksi set media nutrisi. Tabung reaksi yang diinokulasi ditempatkan dalam termostat pada suhu 37 °C dan dijaga secara horizontal selama 2-3 hari sehingga permukaan miring media nutrisi diinokulasi secara seragam dengan suspensi Mycobacterium tuberculosis. Kemudian tabung reaksi dipindahkan ke posisi vertikal dan diinkubasi selama 3-4 minggu. Hasilnya dicatat setelah 3-4 minggu.

Karena waktu yang dibutuhkan untuk mengisolasi patogen dari bahan klinis pada media nutrisi setidaknya 1-1,5 bulan, hasil penentuan kerentanan obat menggunakan metode ini dapat diperoleh paling cepat 2-2,5 bulan setelah penyemaian bahan. Ini adalah salah satu kelemahan utama metode ini.

Hasil uji kepekaan obat terhadap mikobakteri diinterpretasikan berdasarkan kriteria tertentu. Pada media padat, suatu kultur dianggap peka terhadap konsentrasi obat yang terkandung dalam media tersebut jika jumlah koloni mikobakteri yang tumbuh pada tabung reaksi tertentu yang berisi obat tidak melebihi 20 dengan pertumbuhan yang melimpah pada tabung reaksi kontrol tanpa obat. Hanya jika terdapat lebih dari 20 koloni, kultur dianggap resisten terhadap konsentrasi tertentu. Dalam praktiknya, ketika hasil pertumbuhan dalam tabung reaksi yang mendekati 20 CFU diperoleh, perlu untuk memberitahukan unit klinis bahwa kepekaan atau resistensi dalam kasus ini berada pada garis batas, karena hal ini terkadang dapat menjelaskan dinamika indikator klinis yang tidak jelas.

Untuk berbagai sediaan, konsentrasi tertentu ditetapkan di mana reproduksi proporsi kritis populasi mikobakteri diamati. Konsentrasi ini disebut "kritis". Besarnya pertumbuhan populasi mikobakteri pada media nutrisi dengan sediaan dalam konsentrasi kritis digunakan sebagai kriteria stabilitas.

Dalam praktik fisiologi dalam negeri, saat menentukan resistensi obat, tidak terbatas pada penentuan konsentrasi kritis saja. Hal ini disebabkan oleh fakta bahwa definisi yang diperluas tentang tingkat resistensi obat dari patogen memungkinkan dokter untuk merumuskan taktik kemoterapi dengan lebih tepat, menggunakan pengetahuan tentang efek potensiasi kombinasi obat, untuk mengantisipasi resistensi silang atau menggunakan obat yang lebih efektif dari kelompok obat anti-tuberkulosis yang digunakan.

Metode konsentrasi absolut adalah yang paling sederhana, tetapi juga paling sensitif terhadap kesalahan yang dibuat dalam penerapannya. Lebih dapat diandalkan, terutama saat menentukan sensitivitas terhadap obat lini kedua, dan tersebar luas di luar Rusia adalah metode proporsi. Metode ini memperhitungkan kekurangan metode konsentrasi absolut, tetapi lebih padat karya untuk diterapkan.

Metode ini sangat mirip dengan metode konsentrasi absolut. Persiapan tabung reaksi dengan obat-obatan sama seperti pada metode konsentrasi absolut. Namun, dosis benih suspensi mycobacterium tuberculosis dikurangi 10 kali, yang menghilangkan frekuensi resistensi spontan beberapa strain mycobacterium tuberculosis terhadap obat-obatan seperti Ethambutol, prothionamide, capreomycin. Sebagai kontrol, 2 atau 3 tabung dengan dosis benih yang sama dengan yang ada di tabung reaksi, diencerkan secara berurutan 10 dan 100 kali, digunakan. Kriteria resistensi adalah proporsi pertumbuhan mycobacterium tuberculosis yang diamati secara visual. Untuk obat lini pertama, kriteria resistensi adalah pertumbuhan berlebih 1% dari populasi awal, untuk obat lini kedua - pertumbuhan 1 atau lebih dari 10% dari awal, tergantung pada konsentrasi kritis yang dipilih.

Pada tahun 1997, WHO dan kelompok kerja Persatuan Internasional Melawan Tuberkulosis tentang pendeteksian resistansi obat anti-tuberkulosis melakukan penyesuaian terhadap kriteria ini, dengan mengusulkan untuk mempertimbangkan mikobakteri yang tumbuh pada medium telur Lowenstein-Jensen yang padat pada konsentrasi berikut sebagai resistan:

• dihidrostreptomisin - 4 μg/ml;
• isoniazid - 0,2 µg/ml:
• rifampisin - 40 mcg/ml:
• Etambutol - 2 mcg/ml.

Pada tahun 2001, konsentrasi kritis diusulkan untuk obat lini kedua berikut (untuk proporsi kritis 1%):

• kapreomisin - 40 mcg/ml;
• protionamida - 40 mcg/ml;
• kanamisin - 30 μg/ml;
• viomisin - 30 μg/ml;
• sikloserin - 40 mcg/ml;
• asam aminosalisilat - 0,5 mcg/ml;
• ofloksasin - 2 mcg/ml.

Hasil pertumbuhan dinilai setelah 4 minggu sebagai awal dan setelah 6 minggu pembudidayaan sebagai akhir.

Untuk menentukan kerentanan obat terhadap pirazinamid, yang banyak digunakan dalam kemoterapi tuberkulosis modern, konsentrasi kritis yang direkomendasikan adalah 200 μg/ml. Namun, masih belum ada metode yang diterima secara umum untuk menentukan resistensi obat terhadap obat ini pada media nutrisi padat, karena aktivitas antibakterinya hanya terwujud dalam lingkungan asam (pH <6), yang secara teknis sulit dipertahankan. Selain itu, banyak kultur klinis Mycobacterium tuberculosis enggan tumbuh pada media telur dengan lingkungan asam.

Untuk menilai kualitas hasil penentuan kerentanan obat terhadap mikobakteri, disarankan untuk mengontrol setiap batch baru media Lowenstein-Jensen dengan penentuan kerentanan strain museum standar H37Rv secara paralel. Selain itu, ada kriteria mikrobiologi tertentu yang harus dipenuhi agar metode memberikan hasil yang dapat direproduksi dengan baik dan ditafsirkan dengan benar. Ini termasuk viabilitas kultur mikobakteri tuberkulosis, aturan untuk memperoleh suspensi dan suspensi yang homogen, aturan untuk memilih kultur mikobakteri tuberkulosis, dan representasi massa bakteri yang dipilih. Keandalan penentuan resistensi obat menurun dengan ekskresi bakteri yang sangat buruk.

Baru-baru ini, metode penentuan kerentanan obat menggunakan sistem otomatis telah diakui sebagai sesuatu yang menjanjikan. Yang paling maju dalam bidang ini adalah pengembangan berdasarkan VASTEC MGIT-960. Dalam hal ini, kerentanan obat terhadap mikobakteri tuberkulosis ditentukan berdasarkan metode proporsi yang dimodifikasi. Selama penentuan, laju pertumbuhan mikobakteri tuberkulosis dalam tabung kontrol dan dalam tabung dengan obat-obatan dibandingkan. Untuk menentukan kerentanan terhadap streptomisin, isoniazid, rifampisin dan etambutol, aditif pengayaan dan antibiotik yang termasuk dalam kit SIRE digunakan. Untuk menentukan kerentanan terhadap pirazinamid, kit PZA digunakan. Selama pengujian, tabung reaksi dengan obat-obatan diinokulasi dengan suspensi mikobakteri tuberkulosis, serta tabung kontrol dengan pengenceran suspensi 100 kali lipat untuk semua obat, kecuali pirazinamid, di mana pengenceran suspensi adalah 10 kali lipat. Kriteria stabilitas adalah indikator pertumbuhan mikobakteri sebesar 100 GU ketika pertumbuhan dalam tabung kontrol mencapai 400 GU (lihat "Metode kultur untuk mengisolasi mikobakteri"). Hasilnya direkam dan diinterpretasikan secara otomatis dan ditetapkan oleh program yang dimasukkan atau dipilih.

Konsentrasi akhir dalam tabung reaksi dengan media nutrisi cair digunakan sebagai konsentrasi kritis. Saat ini, konsentrasi kritis telah dikembangkan untuk obat lini pertama dan beberapa obat lini kedua. Perlu dicatat bahwa penentuan sensitivitas mikobakteri tuberkulosis terhadap sikloserin dan asam aminosalisilat hanya dilakukan pada media nutrisi telur.

Protokol terperinci untuk bekerja dengan sistem yang dijelaskan memungkinkan pengujian kerentanan obat baik pada kultur yang terisolasi (dengan media nutrisi padat) maupun menggunakan pertumbuhan primer mikobakteri dalam tabung reaksi MGIT. Pilihan terakhir secara signifikan mengurangi waktu yang diperlukan untuk melakukan studi kultur, sehingga memungkinkan hasil lengkap pada kultur mikobakteri tuberkulosis (termasuk informasi tentang kerentanan obat) diperoleh dalam waktu 3 minggu setelah pengumpulan bahan, sedangkan metode tradisional hanya dapat memberikan hasil ini pada bulan ke-3. Hasil yang tepat waktu, ketika pasien berada dalam fase perawatan intensif, dapat mengimbangi biaya studi yang relatif tinggi.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

Diferensiasi mikobakteri

Mengingat bahwa media nutrisi yang digunakan tidak sepenuhnya selektif, diferensiasi mikobakteri yang diisolasi selanjutnya dianggap wajib. Perlunya diferensiasi mikobakteri disebabkan oleh sejumlah fitur proses patologis yang disebabkan oleh perwakilan genus: perjalanan dan hasil tuberkulosis dan mikobakteriosis yang berbeda, adanya resistensi obat alami terhadap beberapa obat antituberkulosis.

Diketahui bahwa identifikasi utama mikobakteri kompleks M. tuberculosis dari mikobakteri non-tuberkulosis dilakukan menurut ciri-ciri berikut: laju pertumbuhan pada media nutrisi padat, pembentukan pigmen, morfologi koloni, adanya ketahanan asam dan suhu optimum untuk pertumbuhan.

Sayangnya, tidak ada metode laboratorium tunggal yang dapat secara andal membedakan mikobakteri kompleks M. tuberculosis dari mikobakteri tahan asam lainnya; namun, kombinasi tanda-tanda yang dijelaskan di atas dengan hasil sejumlah tes biokimia yang diberikan di bawah ini memungkinkan identifikasi mikobakteri kompleks M. tuberculosis dengan probabilitas hingga 95%.

Untuk membedakan mikobakteri kompleks M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovisBCG, M. africanum, M. microti, M. canettii dan lain-lain) dari mikobakteri non-tuberkulosis yang tumbuh lambat, digunakan uji biokimia dasar untuk mendeteksi adanya tanda-tanda berikut:

• kemampuan menghasilkan asam nikotinat (tes niasin):
• aktivitas nitrat reduktase;
• katalase termostabil;
• pertumbuhan pada media dengan natrium salisilat (1 mg/ml).

Sebagai uji tambahan, uji pertumbuhan pada media yang mengandung 500 μg/ml asam para-nitrobenzoat atau 5% natrium klorida juga dapat digunakan.

Banyak laboratorium bakteriologi mengidentifikasi mikroorganisme ini hanya pada tingkat kompleks, yang disebabkan oleh keterbatasan kemampuan laboratorium dan kemampuan metodologis spesialis.

Dalam kebanyakan kasus dalam praktik, uji berikut cukup untuk membedakan M. tuberculosis dan M. bovis: niasin, nitrat reduktase, pirazinamidase, dan registrasi pertumbuhan pada media yang mengandung 2 μg/ml tiofena-2-asam karboksilat hidrazida. Perlu diperhatikan bahwa mikobakteri kompleks M. tuberculosis dicirikan oleh serangkaian fitur berikut:

• pertumbuhan lambat (lebih dari 3 minggu);
• suhu pertumbuhan dalam 35-37 ^o C;
• tidak adanya pigmentasi (warna gading);
• warna tahan asam yang menonjol;
• tes niasin positif;
• tes nitrat reduktase positif;
• tidak adanya katalase termostabil (68 ^o C).
• kurangnya pertumbuhan pada media Lowenstein-Jensen yang mengandung:
  • 1000 µg/ml natrium asam salisilat,
  • 500 mcg/ml asam para-nitrobenzoat,
  • 5% natrium klorida:
• pertumbuhan dengan adanya 1-5 μg/ml asam tiofena-2-karboksilat.

Relevansi diferensiasi mikobakteri yang diisolasi akan meningkat secara signifikan seiring dengan meningkatnya frekuensi pendaftaran kasus HIV/AIDS yang terkait dengan tuberkulosis atau mikobakteriosis. Saat ini, belum ada kepastian mutlak mengenai kesiapan laboratorium regional yang praktis untuk melaksanakan volume pekerjaan ini dengan benar.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

Diagnostik imunologi tuberkulosis

Ada sejumlah fenomena universal, preparat dan uji imunologi yang awalnya ditemukan secara khusus pada tuberkulosis atau dalam model respons imun terhadap mikobakteri. Ini termasuk BCG dan tuberkulin, fenomena seperti skin DST (tes tuberkulin - reaksi Pirquet dan Mantoux), reaksi terhadap pemberian tuberkulin subkutan pada hewan yang tersensitisasi (fenomena Koch). Beberapa antibodi pertama pada penyakit menular juga ditemukan pada tuberkulosis. Tentu saja, semakin dalam pemahaman tentang mekanisme kekebalan anti-tuberkulosis dan kontrol genetiknya, semakin luas penggunaan metode imunologi dan preparat yang memengaruhi kekebalan untuk memecahkan masalah praktis fisiologi.

Masalah praktis yang paling penting dan rumit saat ini dianggap sebagai pendeteksian tuberkulosis dalam proses skrining massal terhadap populasi. Namun, meskipun banyak laporan "keberhasilan" (pada materi terbatas), tidak ada metode imunologi (yang dapat direproduksi di "tangan mana pun") atau obat yang cocok untuk tujuan ini.

Metode imunologi, khususnya studi serologi (penentuan antigen, antibodi) dan uji provokasi tuberkulin, digunakan secara luas dalam praktik klinis.

Metode serologis, yang menentukan antigen dan antibodi di berbagai lingkungan tubuh, menempati urutan pertama di antara studi imunologis yang digunakan dalam diagnostik diferensial.

Spesifisitas penentuan antibodi terhadap mikobakteri tuberkulosis bergantung pada antigen yang digunakan dalam analisis imun. Sejumlah besar antigen telah diusulkan, yang pertama adalah tuberculin PPD:

• PPD dan preparat kompleks lainnya dari cairan kultur;
• penghancur ultrasonik;
• Ekstrak Triton dan preparat dinding sel kompleks lainnya;
• 5-antigen (Daniel);
• 60-antigen (Coccito);
• lipoarabinomanan;
• faktor tali pusat (trehalosa-6,6-di-mikolat);
• fenolik dan glikolipid lainnya;
• lipopolisakarida;
• antigen pengikat fibronektin;
• protein (paling sering rekombinan); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 KDA, dll.

Sebagai hasil dari penelitian bertahun-tahun oleh para ilmuwan Rusia dan asing, pola utama pembentukan antibodi dan efektivitas diagnostik serologis tuberkulosis diidentifikasi: semakin kompleks antigen, semakin tinggi sensitivitas dan semakin rendah spesifisitas tes. Spesifisitas bervariasi di berbagai negara tergantung pada infeksi populasi dengan M. tuberculosis dan mikobakteri non-tuberkulosis, pada vaksinasi BCG, dll. Pada anak-anak, keinformatifan serodiagnostik lebih rendah daripada pada orang dewasa. Pada tuberkulosis primer (lebih sering pada anak-anak), penentuan IgM lebih informatif; pada tuberkulosis sekunder - IgG. Pada orang yang terinfeksi HIV, keinformatifan serodiagnostik dalam menentukan antibodi berkurang. Efektivitas penentuan antibodi bergantung pada sejumlah "momen klinis": aktivitas proses (ada atau tidaknya "isolasi" mikobakteri, adanya rongga pembusukan, tingkat infiltrasi), prevalensi proses, durasi perjalanannya.

Sensitivitas metode enzyme immunoassay (EIA) sekitar 70%. Kurang efektifnya penelitian ini disebabkan oleh spesifisitasnya yang rendah. Sebelumnya, kemungkinan penggunaan skrining serologis pada kelompok berisiko tinggi telah dipertimbangkan, khususnya di antara orang-orang dengan perubahan paru pasca-tuberkulosis.

Untuk meningkatkan spesifisitas ELISA, antigen yang lebih spesifik sedang dicari, termasuk yang diperoleh dengan rekayasa genetika: ESAT-6, dll. (lihat di atas). Penggunaan antigen yang sangat spesifik (38 kDa, ESAT) meningkatkan spesifisitas, tetapi secara signifikan mengurangi sensitivitas analisis. Bersamaan dengan ELISA (sistem uji laboratorium eksperimental, seperti kit ELISA Pathozyme), kit imunokromatografi dengan filtrasi lateral (Mycodot) juga ditawarkan, serta tes serupa lainnya (analisis titik membran) dengan penilaian visual dari hasil uji. Saat melakukan tes ini, analisis memakan waktu 10-30 menit; mereka tidak memerlukan peralatan khusus, mereka memerlukan penilaian visual dari hasil, yang dikaitkan dengan subjektivitas tertentu. Metode-metode ini memiliki karakteristik sensitivitas dan spesifisitas yang kira-kira sama (masing-masing 70% dan 90-93%) seperti ELISA tradisional.

Penggunaan metode analisis imun memiliki nilai tertentu sebagai metode tambahan yang diperhitungkan dalam kompleks metode yang digunakan dalam diagnosis diferensial tuberkulosis, terutama dalam diagnosis bentuk ekstra paru. Metode ELISA paling efektif dalam diagnosis meningitis tuberkulosis saat memeriksa cairan serebrospinal. Dalam hal ini, sensitivitas analisis adalah 80-85%, dan spesifisitasnya adalah 97-98%. Ada informasi tentang efektivitas penentuan antibodi terhadap Mycobacterium tuberculosis dalam cairan air mata dalam diagnosis uveitis tuberkulosis.

Induksi sintesis interferon gamma secara in vitro

Gamma interferon (IFN-γ) merupakan faktor perlindungan imun spesifik, yang diwujudkan dengan mengaktifkan sistem enzim makrofag. Induksi sintesis IFN-γ oleh limfosit T yang tersensitisasi disebabkan oleh interaksinya dengan antigen mikobakteri.

Baik tuberkulin PPD maupun antigen spesifik yang diperoleh melalui rekayasa genetika digunakan sebagai antigen, khususnya antigen ESAT-6 (antigen yang disekresikan lebih awal dengan berat molekul 6 kDa) dan CFP-10 (protein filtrat kultur, 10 kDa). Antigen yang direkayasa secara genetika atau rekombinan tidak ada dalam sel vaksin BCG dan mikobakteri lainnya. Saat menggunakan tuberkulin, hasil uji induksi IFN-γ sebanding dengan hasil uji kulit tuberkulin (korelasi langsung). Saat menggunakan antigen yang direkayasa secara genetika, hasil uji lebih spesifik dan tidak bergantung pada vaksinasi BCG sebelumnya. Saat memeriksa individu yang divaksinasi yang belum pernah kontak dengan infeksi tuberkulosis, spesifisitas uji adalah 99%. Sensitivitas uji di antara pasien tuberkulosis berkisar antara 81 hingga 89%.

Pengujian dan diagnostik telah dikembangkan berdasarkan kultivasi jangka pendek sel darah utuh atau sel mononuklear yang diisolasi dari darah dengan antigen mikobakteri tuberkulosis secara in vitro, diikuti dengan penentuan konsentrasi IFN-γ atau penghitungan jumlah limfosit T yang mensintesis IFN-γ. Konsentrasi interferon yang disintesis dalam tabung reaksi ditentukan dengan ELISA menggunakan antibodi monoklonal yang mengikat IFN-γ. Kemudian, dengan menggunakan kalibrasi IFN-γ standar, konsentrasinya dalam tabung reaksi atau sumur pelat ditentukan.

Dalam uji Elispot, jumlah sel T yang mensintesis IFN-γ dihitung pada permukaan cawan yang dilapisi antibodi terhadap IFN-γ.

Pengembang diagnostik induksi IFN-γ in vitro, yang disetujui oleh Badan Pengawas Obat dan Makanan AS, mengklaim bahwa tes tersebut tidak dapat membedakan infeksi tuberkulosis laten dari tuberkulosis aktif. Oleh karena itu, di wilayah dengan tingkat infeksi tinggi, tes tersebut tidak memiliki nilai diagnostik langsung. Namun, di negara kita, tes tersebut dapat digunakan untuk membedakan infeksi tuberkulosis pada anak-anak dari alergi pasca-vaksinasi, serta untuk menilai tingkat kekebalan spesifik selama perawatan.

Saat ini, sistem pengujian dalam negeri untuk menentukan induksi sintesis IFN-γ oleh antigen tuberkulosis spesifik secara in vitro sedang dipelajari.

Status imun dan perjalanan penyakit tuberkulosis, imunokoreksi

Selama pengobatan tuberkulosis, perubahan antigenemia dan keadaan sistem imun terjadi pada orang.

Data tentang perubahan eksudat dan jaringan sebagian besar saling bertentangan. Satu-satunya hal yang dapat dicatat dengan pembenaran penuh adalah bahwa granuloma tuberkulosis, sebagai suatu peraturan, mengandung sejumlah besar limfosit T yang diaktifkan.

Ada baiknya kita bahas dua poin lagi yang diperlukan untuk memahami peran mekanisme imunologi dalam pengobatan tuberkulosis pada manusia:

• Pasien AIDS memiliki insiden yang sangat tinggi dalam mengembangkan resistensi terhadap banyak obat;
• Pada kasus resistensi banyak obat (dan tanpa adanya infeksi HIV), gangguan imun (utamanya imunitas sel T) sangatlah signifikan.

Pada tuberkulosis, berbagai metode imunokoreksi digunakan secara luas: pertama-tama, ini adalah obat-obatan yang bekerja terutama pada imunitas sel T dan sistem fagosit mononuklear (hormon timus, isophone, licopid, polioksidonium, dll.), serta mikobakteri utuh (yang dilemahkan) dan komponen-komponennya.

Diagnostik biologi molekular tuberkulosis

Metode biologi molekular dalam diagnostik penyakit menular terutama mencakup metode yang didasarkan pada manipulasi bahan genom patogen bakteri dan virus untuk mengidentifikasi bahan genetik tertentu - potongan DNA dengan urutan nukleotida yang spesifik untuk spesies atau galur patogen tertentu, untuk menganalisis urutan DNA tertentu dalam gen yang menentukan sensitivitas patogen terhadap obat tertentu, serta untuk menganalisis aktivitas fungsional gen patogen tertentu. Metode biologi molekular telah tersebar luas dalam penelitian ilmiah dan aplikasi praktis dalam diagnostik dan pemantauan berbagai infeksi bakteri dan virus setelah penemuan reaksi berantai polimerase pada tahun 1985 oleh Carrie Mullis (pemenang Hadiah Nobel, 1989).

Prinsip dan kemampuan metode reaksi berantai polimerase

PCR memungkinkan amplifikasi (perbanyakan) urutan nukleotida (fragmen DNA patogen) dalam tabung reaksi dalam beberapa jam hingga jutaan kali. Melakukan reaksi dengan adanya rantai DNA tunggal menentukan sensitivitas analisis yang sangat tinggi.

Urutan nukleotida pada bagian tertentu rantai DNA menentukan keunikan genetik mikroorganisme, yang menjelaskan spesifisitas PCR yang tinggi.

Pentingnya metode ini untuk mendeteksi dan mempelajari ciri-ciri Mycobacterium tuberculosis adalah karena sifat biologis mikroorganisme ini yang pertumbuhannya sangat lambat: waktu penggandaan DNA Mycobacterium tuberculosis selama pembudidayaannya adalah 12-24 jam.

Prinsip metode PCR adalah amplifikasi - perkalian berganda, jutaan kali, bagian-bagian dari urutan DNA tertentu dalam tabung reaksi mikrovolume dengan pengulangan siklik dari tiga tahap reaksi berikut, yang masing-masing berlangsung dalam rezim suhu yang berbeda:

• Tahap I - denaturasi DNA untai ganda saat dipanaskan dengan divergensi rantainya;
• Tahap II - pengikatan komplementer (hibridisasi) primer (oligonukleotida priming) dengan bagian ujung rantai fragmen DNA spesifik yang dipilih untuk amplifikasi;
• Tahap III – penyelesaian rantai fragmen DNA menggunakan DNA polimerase termostabil.

Untuk amplifikasi, tabung reaksi harus berisi molekul DNA matriks. Empat jenis deoksinukleosida trifosfat (nukleotida) yang mengandung basa nitrogen yang sesuai: adenina (A), timina (T), guanin (G), sitosin (C); oligonukleotida priming (primer) yang disintesis secara artifisial yang terdiri dari 18-20 pasangan basa; enzim termostabil, DNA polimerase, dengan suhu optimum 68-72 ^° C, dan ion magnesium.

Spesifisitas PCR bergantung pada pilihan fragmen DNA. Sesuai dengan itu, oligonukleotida primer yang mengapit disintesis. Spesifisitas hibridisasi dan penyelesaian rantai DNA ditentukan oleh prinsip komplementaritas pasangan basa nitrogen berikut: adenin-timin, guanin-sitosin.

Untuk menentukan genom mikobakteri kompleks tuberkulosis, target amplifikasi yang paling efektif dalam sebagian besar sistem pengujian adalah fragmen DNA IS6110, yang pada sebagian besar galur mikobakteri tuberkulosis memiliki jumlah pengulangan yang signifikan (10-20) dalam genom, yang memastikan, bersama dengan spesifisitas, sensitivitas analisis yang tinggi. Pada saat yang sama, galur mikobakteri tuberkulosis dengan jumlah pengulangan yang sedikit atau tidak adanya fragmen IS6110 telah dijelaskan.

Ekstraksi molekul DNA dari sampel biologis

Untuk melakukan PCR, molekul DNA patogen harus diisolasi dari bahan biologis dalam volume minimal, dengan jumlah minimal DNA nonspesifik dan berbagai penghambat enzim - DNA polimerase.

Persiapan sampel harus dilakukan dalam kondisi yang mencegah kontaminasi silang sampel yang diteliti dengan molekul DNA yang diisolasi. Ini memerlukan perawatan awal ruangan dengan sinar ultraviolet, lantai dan permukaan meja serta peralatan - dengan larutan yang mengandung klorin. Juga perlu menggunakan sarung tangan bersih, tabung reaksi sekali pakai, dan ujung pipet otomatis.

Untuk mengisolasi DNA Mycobacterium tuberculosis dari sampel klinis (cairan serebrospinal, bilasan bronkial) yang tidak mengandung sejumlah besar leukosit, serpihan sel atau garam, cukup dengan mensentrifus sampel pada 3-4 ribu putaran per menit, menambahkan 20-30 µl larutan Triton X-100 2% ke sedimen dan memanaskannya pada suhu 90 ^o C selama 30 menit.

Persiapan sampel dahak memerlukan pencairan yang efisien, biasanya menggunakan 4% natrium hidroksida dan N-asetil-L-sistein (NALC) pada 50-80 mg per sampel, tergantung pada viskositas sampel. Larutan NALC harus disiapkan secara spontan, atau bubuk NALC dapat ditambahkan kering langsung ke sampel. Setelah pencairan, sampel harus disentrifugasi selama 15 menit pada 3.500-4.000 rpm (3.000 g) dalam tabung bertutup ulir 50 ml, yaitu dalam kondisi yang sama yang direkomendasikan untuk persiapan dahak pra-kultur.

Untuk mengekstrak DNA dari sedimen, metode yang paling sering digunakan adalah larutan guanidin isothiocyanate 5-6 molar sebagai reagen lisis dan partikel silikon oksida mikropori ("tanah diatom") yang menyerap molekul DNA. Zat-zat yang tidak spesifik, termasuk kemungkinan inhibitor, kemudian dicuci dalam larutan guanidin isothiocyanate 2,5 molar dan larutan etanol, setelah itu molekul DNA didesorpsi dalam air, dan sampel ini digunakan untuk melakukan PCR. Untuk menyederhanakan teknologi ekstraksi DNA, "tanah diatom" sering diganti dengan mikropartikel magnetik yang dilapisi silikon oksida. Dalam hal ini, dudukan magnetik khusus untuk tabung mikro digunakan untuk mengendapkan partikel alih-alih sentrifugasi.

Metode asli pemisahan imunomagnetik mikobakteri dengan ekstraksi DNA patogen berikutnya telah dikembangkan di Rusia. Untuk pemisahan imunomagnetik mikobakteri tuberkulosis, ferropartikel berukuran 3-5 μm, dilapisi dengan silikon oksida, digunakan, yang ditempelkan antibodi poliklonal (kelinci) terhadap mikobakteri tuberkulosis melalui ikatan kimia. Sampel dahak setelah lisis alkali dinetralkan dengan larutan Tris-HCl asam dan diinkubasi dengan sorben imunomagnetik. Kemudian imunoferropartikel dikumpulkan menggunakan batang magnet dengan ujung yang dapat diganti, dipindahkan ke tabung mikro, dan diendapkan. 20-30 μl larutan Triton X-100 2% ditambahkan dan dipanaskan selama 30 menit pada suhu 90 ^o C. Supernatan digunakan sebagai matriks DNA untuk analisis PCR.

Masalah yang sulit adalah ekstraksi DNA mikobakterium tuberkulosis dari spesimen biopsi. Untuk lisis biopsi, enzim proteinase K digunakan pada konsentrasi akhir 200-500 mg/l pada suhu 56 ^o C semalaman. Kemudian, enzim tersebut diekstraksi menggunakan salah satu metode yang dikenal. Kelebihan DNA non-spesifik dalam analisis PCR spesimen biopsi sering kali menyebabkan penghambatan reaksi, yang memerlukan ekstraksi DNA berulang.

Metode deteksi hasil

Setelah reaksi selesai, fragmen DNA patogen yang teramplifikasi diidentifikasi menggunakan berbagai metode.

Metode elektroforesis gel sudah dikenal luas. Dalam kasus ini, fragmen DNA yang diperoleh diidentifikasi oleh kontrol positif yang mengandung fragmen DNA spesifik yang diinginkan, atau oleh ukuran fragmen (jumlah pasangan nukleotida) yang diketahui sebelumnya, yang ditentukan menggunakan penanda molekuler standar.

Dengan adanya pewarna tertentu - etidium bromida, yang termasuk dalam DNA beruntai ganda, fragmen DNA yang disintesis tampak sebagai pita yang bersinar di bawah pengaruh cahaya ultraviolet.

Ukuran fragmen DNA, ditentukan oleh elektroforesis berdasarkan jarak yang ditempuh dari awal, harus sesuai dengan penanda berat molekul yang diketahui atau kontrol positif.

Metode lain untuk menentukan hasil PCR didasarkan pada hibridisasi produk PCR untai tunggal dengan oligonukleotida komplementer - pemeriksaan DNA berlabel biotin, diikuti oleh deteksi menggunakan reaksi enzimatik dengan, misalnya, mengikat konjugat streptavidin-alkali fosfatase ke biotin.

Berdasarkan jenis deteksi ini, telah diciptakan alat analisis PCR yang mana deteksi hasil PCR dilakukan secara otomatis sebagai hasil pembacaan kerapatan optik dalam sampel setelah terjadinya reaksi enzimatik.

Kerugian dari metode ini meliputi kemungkinan terjadinya kontaminasi intralaboratorium dengan fragmen molekul DNA yang cukup pendek. Ketika molekul ini memasuki sampel yang baru diuji, molekul tersebut menjadi matriks untuk PCR dan menyebabkan hasil positif palsu.

Dalam hal ini, untuk mencegah hasil positif palsu, aturan ketat diberlakukan untuk memisahkan dan mengisolasi ruangan: untuk ekstraksi DNA dari sampel biologis; ruangan untuk mendeteksi hasil (elektroforesis) dari zona bersih. Ruangan-ruangan ini merupakan zona kemungkinan kontaminasi. Zona terisolasi lainnya adalah ruangan bersih untuk memasukkan sampel DNA yang diteliti ke dalam tabung reaksi dengan campuran reaksi untuk PCR. Dan terakhir, diasumsikan bahwa perangkat utama - penguat DNA - harus dibawa ke ruangan terpisah, mungkin kantor.

Untuk mencegah kontaminasi oleh produk reaksi sebelumnya - amplikon, beberapa sistem uji PCR mengandung deoksinukleosida uridina sebagai pengganti deoksinukleosida timidina, yang dibangun pada posisi yang sesuai selama sintesis rantai in vitro, yaitu basa nitrogen timina yang ada dalam DNA asli digantikan oleh urasil. Glikosilase DNA urasil yang ditambahkan ke campuran reaksi bahan yang dianalisis hanya menghancurkan fragmen yang terkontaminasi dengan deoksiuridina, tetapi tidak DNA asli yang dianalisis yang mengandung deoksitimidina. Pemanasan berikutnya pada suhu 94 ^o C menonaktifkan enzim ini dan tidak mengganggu amplifikasi dalam PCR.

Terdapat sistem pengujian berdasarkan amplifikasi isotermal rRNA, yang mana transkripsi balik dan sintesis molekul DNA dilakukan terlebih dahulu, yang selanjutnya menjadi matriks untuk sintesis molekul RNA berikutnya. Amplikon RNA dideteksi menggunakan probe DNA yang diwarnai akridin selama hibridisasi dalam larutan tabung reaksi. Metode ini, selain memiliki sensitivitas tinggi, memiliki keuntungan melakukan analisis dalam satu tabung, yang mencegah kontaminasi. Menurut penulis, sensitivitas metode ini dalam sampel pernapasan mencapai 90% dengan spesifisitas 99-100%.

Metode deteksi baru diterapkan dalam PCR waktu nyata. Perbedaan utama metode ini adalah PCR dan deteksi hasilnya dilakukan secara bersamaan dalam satu tabung reaksi tertutup. Hal ini tidak hanya menyederhanakan metode analisis secara teknologi, tetapi juga mencegah kontaminasi tempat laboratorium dan sampel oleh produk PCR sebelumnya.

Dalam PCR waktu nyata, hasil dideteksi oleh fluoresensi yang timbul dari hibridisasi probe DNA fluorogenik dengan fragmen DNA spesifik yang diperkuat selama PCR. Struktur probe DNA fluorogenik dibangun sedemikian rupa sehingga penanda fluoresensi dilepaskan sebagai hasil dari reaksi enzimatik atau menjauhkan diri dari molekul peredam fluoresensi hanya setelah hibridisasi spesifik dengan molekul DNA yang diinginkan yang diperkuat selama PCR. Ketika jumlah molekul yang dihibridisasi dengan probe meningkat, peningkatan fluoresensi ke tingkat yang dapat dideteksi sebanding dengan jumlah molekul produk yang diperkuat. Karena jumlah molekul fragmen DNA berlipat ganda selama setiap siklus PCR, nomor siklus tempat fluoresensi dideteksi dan meningkat berbanding terbalik dengan jumlah molekul DNA dalam sampel asli. Jika beberapa konsentrasi molekul yang diketahui dari fragmen DNA mikobakterium tuberkulosis yang sesuai dimasukkan ke dalam reaksi sebagai kalibrator, maka jumlah genom DNA dalam material yang sedang dipelajari dapat dihitung menggunakan program komputer.

Setiap sampel standar diduplikasi. Kriteria kuantitatif adalah jumlah minimum siklus PCR yang diperlukan untuk timbulnya dan pertumbuhan fluoresensi yang dapat dideteksi. Sumbu absis adalah jumlah siklus; sumbu ordinat adalah nilai fluoresensi. Konsentrasi DNA berbanding terbalik dengan jumlah siklus yang diperlukan agar fluoresensi muncul. Jendela di kolom kanan (21-32) menunjukkan nomor siklus untuk konsentrasi yang sesuai. Perbedaan antara konsentrasi 10 kali lipat fragmen DNA 10 ² -10 ⁶ ml adalah 3,2-3,4 siklus. Untuk dua pasien, konsentrasi fragmen IS6110 adalah sekitar 10 ³ /ml dan 10 ⁴ /ml. Dengan mempertimbangkan jumlah pengulangan (6-20) fragmen yang dianalisis dalam genom Mycobacterium tuberculosis, jumlah Mycobacterium tuberculosis dalam sampel klinis masing-masing adalah sekitar 100 dan 1000 sel.

Aplikasi PCR dalam diagnosis tuberkulosis

Metode PCR digunakan secara luas untuk diagnosis cepat tuberkulosis - deteksi Mycobacterium tuberculosis dalam sampel klinis: dahak, bilasan bronkial, eksudat pleura, urin, cairan serebrospinal, tusukan osteolisis, aspirasi saluran genital wanita dan berbagai biopsi. Dalam sebuah penelitian di Belanda terhadap sekitar 500 sampel dahak dan bilasan bronkial dari 340 pasien dengan diagnosis tuberkulosis paru yang dikonfirmasi, sensitivitas komparatif metode PCR, kultur dan mikroskopi apusan dipelajari. Sensitivitas analisis masing-masing adalah 92,6, 88,9 dan 52,4%. Spesifisitas semua metode sekitar 99%.

Perbandingan dilakukan terhadap efisiensi deteksi Mycobacterium tuberculosis menggunakan mikroskopi apusan, penyemaian pada medium Lowenstein-Jensen, sistem uji VASTES, dan analisis PCR. PCR menunjukkan sensitivitas sebesar 74,4%, mikroskopi - 33,8%, penyemaian pada medium padat - 48,9%, dan VASTES - 55,8%. Waktu deteksi rata-rata untuk penyemaian pada medium Lowenstein-Jensen adalah 24 hari. VASTES - 13 hari, PCR - 1 hari.

Potensi penggunaan PCR sebagai metode yang sensitif dan cepat untuk memantau efektivitas pengobatan tuberkulosis juga dibahas.

Deteksi DNA Mycobacterium tuberculosis dengan metode PCR dengan kemoterapi yang efektif ditentukan dalam jangka waktu yang lebih lama - rata-rata 1,7 bulan dibandingkan dengan ekskresi bakteri yang ditentukan oleh mikroskop fluoresensi, dan 2,5 bulan dibandingkan dengan pemeriksaan bakteriologis.

Diagnosis bentuk tuberkulosis ekstra paru

Pentingnya PCR sebagai metode yang sensitif terutama besar untuk bentuk ekstraparu, karena justru dalam bentuk inilah metode klinis dan radiologis serta metode bakteriologis tradisional untuk menentukan Mycobacterium tuberculosis dalam bahan diagnostik tidak efektif.

Pada pemeriksaan sampel urine, hasil analisis PCR menunjukkan positif pada 16 dari 17 pasien dengan tuberkulosis aktif pada sistem kemih, negatif pada 4 pasien dengan tuberkulosis ginjal tidak aktif, dan 39 pasien dengan penyakit non-tuberkulosis pada sistem kemih.

Efisiensi analisis PCR dalam studi aspirasi sumsum tulang pada pasien dengan demam yang tidak diketahui genesisnya dengan dugaan sifat tuberkulosis penyakit ini telah dibuktikan. Untuk diagnosis limfadenitis tuberkulosis pada anak-anak, 102 aspirasi tusukan dan sampel biopsi dari 67 anak dengan dugaan limfadenitis tuberkulosis dipelajari. Hasil positif diperoleh: dengan PCR waktu nyata - 71,6%, mikroskopi fluoresensi - 46,3%, studi kultur - 41,8%. Dalam studi 50 biopsi kelenjar getah bening pada pasien dengan penyakit cakaran kucing, semua hasilnya negatif. Dengan demikian, spesifisitas 100% analisis PCR telah dibuktikan. Dalam pekerjaan yang sama, kemungkinan mendeteksi M. avium ditunjukkan dalam biopsi tusukan kelenjar getah bening.

Diagnosis tuberkulosis genital wanita pada infertilitas diketahui sebagai salah satu masalah diagnostik yang paling sulit. Hasil positif diperoleh dalam studi PCR biopsi endometrium, aspirasi endometrium, dan sampel cairan kantong Douglas pada 14 (56%) dari 25 pasien yang diperiksa secara laparoskopi dengan dugaan tuberkulosis. Mikroskopi apusan dan studi kultur menghasilkan 1 dan 2 hasil positif, masing-masing. Kasus-kasus ini juga PCR-positif. Sebagian besar hasil PCR-positif adalah pada kasus-kasus dengan ciri-ciri khas tuberkulosis menurut pemeriksaan histologis; jumlah yang lebih kecil adalah pada kasus-kasus dengan dugaan tuberkulosis menurut laparoskopi. Hanya satu hasil PCR positif diperoleh tanpa adanya data laparoskopi untuk tuberkulosis.

Saat mendiagnosis bentuk tuberkulosis ekstra paru, dokter sering kali memiliki pertanyaan tentang kemungkinan mengidentifikasi patogen saat memeriksa sampel darah menggunakan metode PCR. Data literatur menunjukkan bahwa deteksi DNA Mycobacterium tuberculosis dari sampel darah dimungkinkan pada bentuk infeksi HIV tingkat lanjut. DNA Mycobacterium tuberculosis hanya terdeteksi pada tuberkulosis umum pada berbagai organ pada pasien dengan ginjal yang ditransplantasikan dan imunosupresi.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

Identifikasi spesies mikobakteri

Metode PCR dapat cukup efektif untuk identifikasi cepat mikobakteri kompleks tuberkulosis dan beberapa jenis mikobakteri nontuberkulosis setelah memperoleh pertumbuhan primernya. Dalam kasus ini, penggunaan PCR dapat menghemat waktu 7-10 hari yang diperlukan untuk identifikasi kultur berikutnya dari hasil positif. Studi PCR secara teknis sangat sederhana, karena tidak memerlukan persiapan sampel bahan klinis yang rumit untuk mencapai sensitivitas tinggi. Saat memeriksa 80 kultur positif dalam sistem pengujian tersebut (MB BacT. oleh Organon), semua hasil analisis PCR positif benar-benar spesifik dan dilakukan dalam waktu 1 hari. Untuk mengidentifikasi jenis mikobakteri lain saat diperoleh dalam kultur, DNA patogen dihibridisasi dengan probe DNA spesifik yang diberi label dengan akridin, dan strain dideteksi dengan munculnya kemiluminesensi menggunakan kemiluminometer atau pada strip nitroselulosa dengan penilaian visual setelah hibridisasi. Kit ini mengidentifikasi sejumlah spesies terbatas: Kompleks Mycobacterium tuberculosis, M. avium, Kompleks M. avium, M. kansasii, dan M. gordonae.

A. Telenti dkk. juga mengembangkan metode yang relatif sederhana dan murah untuk identifikasi spesies mikobakteri yang penting secara klinis berdasarkan PCR dan perlakuan selanjutnya dengan dua enzim restriksi (enzim yang memiliki kemampuan untuk memotong molekul DNA pada titik-titik tertentu). Dalam kasus ini, fragmen DNA yang mengkode protein syok panas (65 kDa) diperkuat, setelah itu fragmen DNA yang diperoleh dalam PCR, berukuran 439 pasangan nukleotida, diperlakukan secara terpisah dengan dua enzim - Bste II dan Нае III. Kemudian, menggunakan elektroforesis gel agarosa, kedua produk yang diperoleh dianalisis, menentukan ukurannya (jumlah pasangan nukleotida) menggunakan serangkaian fragmen DNA standar (penanda DNA molekuler) dari 100 hingga 1000 pasangan nukleotida panjangnya. Pada masing-masing spesies yang ditentukan (M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M.fortuitum) 2 atau 3 fragmen DNA dengan ukuran yang berbeda ditemukan untuk setiap enzim restriksi. Kombinasi fragmen DNA yang dihasilkan dengan ukuran berbeda memungkinkan spesies ini dibedakan satu sama lain.

Sebuah teknologi untuk mikroarray DNA biologis sedang dikembangkan yang akan membantu mengidentifikasi lebih dari 100 spesies mikobakteri dalam satu penelitian.

Identifikasi spesies juga dapat dilakukan menggunakan amplifikasi PCR pada daerah variabel 16S rRNA diikuti dengan pengurutan amplikon dibandingkan dengan struktur primer yang sesuai, yang memungkinkan identifikasi lebih dari 40 spesies mikobakteri.

PCR juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi spesies dalam kompleks mikobakterium tuberkulosis, termasuk diferensiasi antara M. bovis dan M. bovis BCG. Hal ini dilakukan dengan menganalisis keberadaan atau ketiadaan gen tertentu dalam wilayah genom RD1, RD9, dan RD10. RD1 tidak ada dalam M. bovis BCG, tetapi ada dalam spesies virulen, termasuk M. bovis.

Penentuan kerentanan obat Mycobacterium tuberculosis menggunakan PCR

Tugas metode genetik molekuler untuk menentukan sensitivitas atau resistensi obat Mycobacterium tuberculosis direduksi menjadi identifikasi mutasi pada urutan nukleotida tertentu dari gen yang diketahui. Metode utama didasarkan pada pembacaan langsung (pengurutan) urutan ini setelah amplifikasi, atau pada hibridisasi fragmen DNA berlabel biotin yang diamplifikasi selama PCR dengan probe DNA. Kedua opsi melibatkan identifikasi substitusi dalam urutan nukleotida yang, saat menggunakan probe DNA, menyebabkan tidak adanya atau hibridisasi yang tidak lengkap pada membran nitroselulosa menggunakan konjugat enzim (streptavidin-alkaline phosphatase) - metode LIPA-Rif-TB.

Metode pengukuran fluoresensi dalam probe DNA yang difiksasi secara lokal pada mikroregion yang komplementer terhadap mutasi yang diketahui pada region gen yang diamplifikasi PCR yang bertanggung jawab atas sensitivitas atau resistensi obat disebut metode microbiochips. Algoritme dasar untuk melakukan studi ini adalah sebagai berikut. Setelah DNA diisolasi dari sampel klinis atau kultur mikobakteri, PCR harus dilakukan untuk mengamplifikasi fragmen yang sesuai dari gen groB yang bertanggung jawab atas sensitivitas obat terhadap rifampisin, atau gen katG dan inhA yang mengkode protein mikobakteri yang bertanggung jawab atas sensitivitas terhadap isoniazid. Hasil PCR dinilai menggunakan elektroforesis gel agarosa, yang mengonfirmasi penerimaan fragmen DNA yang sesuai dengan panjang yang diinginkan. Kemudian, putaran PCR ke-2 dilakukan untuk memasukkan label fluoresensi ke dalam DNA. Hasil PCR dikonfirmasi lagi dengan elektroforesis gel. Setelah ini, hibridisasi dilakukan (inkubasi semalam) dengan pencucian selanjutnya dari bahan yang diperoleh pada biochip, yang merupakan sejumlah besar rantai DNA pendek (probe) yang dipasang pada pelat kaca kecil, yang melengkapi urutan nukleotida dari jenis mikobakteri tuberkulosis yang sensitif terhadap obat pada titik-titik kemungkinan mutasi. serta urutan mutan yang bertanggung jawab atas resistensi obat. Lokasi probe DNA pada pelat ditentukan secara ketat, dan tingkat fluoresensi yang diamati selama hibridisasi untuk menentukan hasil menggunakan perangkat pembacaan khusus ditetapkan. Dalam hal ini, hasil analisis ditentukan menggunakan program komputer khusus.

Dalam beberapa tahun terakhir, metode alternatif untuk menentukan sensitivitas obat Mycobacterium tuberculosis telah dikembangkan berdasarkan teknologi PCR waktu nyata, yang memungkinkan penelitian ini dilakukan dalam mode tabung reaksi tertutup.

Gambar 13-13 menunjukkan hasil analisis kultur klinis Mycobacterium tuberculosis dalam menentukan resistensi obat terhadap rifampisin menggunakan PCR real-time: 218 - sampel kontrol (sensitif terhadap rifampisin); 93 - kontrol positif untuk mutasi Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - kontrol positif untuk mutasi Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - sampel eksperimen. Hasil perhitungan kurva kinetik amplifikasi untuk 4 saluran: saluran 1: 393 - kontrol positif untuk mutasi Ser-Trp TCG-TGG; saluran 2: 4482 - kontrol positif untuk mutasi Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - sampel eksperimen; saluran 4: kurva kinetik amplifikasi semua sampel yang berpartisipasi dalam eksperimen. Kontrol positif reaksi amplifikasi. Kesimpulan: Analisis mengungkap mutasi berikut yang menentukan resistensi terhadap rifampisin: pada sampel 162,163,172,295 - Ser-Leu TCG-TTG. Prinsip yang sama digunakan untuk menentukan resistensi obat terhadap isoniazid oleh gen katG dan inhA, yang menentukan mutasi yang paling sering terjadi.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

Identifikasi Strain Mycobacterium tuberculosis

Metode identifikasi strain Mycobacterium tuberculosis yang paling banyak dipelajari adalah teknologi yang disebut polimorfisme panjang fragmen restriksi (RFLP) dan yang didasarkan pada fragmentasi (restriksi) DNA Mycobacterium tuberculosis oleh enzim Pvu II dan hibridisasi fragmen yang diperoleh selanjutnya dengan urutan spesifik tertentu pada DNA elemen pengulangannya IS6110. Variabilitas intraspesifik terwujud karena perbedaan jumlah pengulangan IS6110 dan lokasinya pada DNA, serta keragaman jarak antara titik serangan tertentu dari enzim restriksi (situs restriksi) dan elemen IS6110. Teknologi ini sangat kompleks dan padat karya. Setelah memperlakukan DNA yang diisolasi dari kultur mycobacterium tuberculosis dengan enzim restriksi, elektroforesis gel dilakukan, kemudian fragmen DNA dengan panjang yang berbeda ditransfer ke membran nitrocellulose, dihibridisasi dengan fragmen elemen IS6110, dan hasilnya dideteksi menggunakan reaksi enzimatik. Pola pita spesifik yang dihasilkan mengkarakterisasi DNA dari strain mycobacterium tuberculosis tertentu. Analisis komputer mengungkap identitas atau hubungan galur. Meskipun metode RFLP merupakan yang paling diskriminatif, yaitu mengungkap jumlah perbedaan terbesar pada galur yang dianalisis, metode ini tidak efektif dengan sejumlah kecil (kurang dari 5) pengulangan IS6110, yang diamati pada beberapa galur. Gambar 13-14 menunjukkan hasil pengetikan RFLP pada galur.

Alternatifnya adalah metode spoligotyping - analisis polimorfisme urutan DNA spacer - intermediet antara pengulangan langsung daerah DR. Saat melakukan spoligotyping strain, PCR dilakukan dengan primer yang membatasi daerah DR, setelah itu fragmen dengan panjang berbeda terbentuk, yang berhibridisasi dengan daerah DNA intermediet variabel. Analisis urutan spacer daerah DR tampaknya, menurut para peneliti, lebih sederhana, lebih produktif dan cocok untuk penyaringan primer strain dan analisis epidemiologi awal, serta untuk mempelajari materi klinis secara langsung.

Jelas, metode yang lebih efektif dan dapat diakses secara teknologi adalah VNTR (singkatan dari kata-kata bahasa Inggris), atau metode untuk menentukan jumlah variabel pengulangan tandem yang tepat dalam DNA mycobacterium tuberculosis. Metode ini hanya didasarkan pada penggunaan PCR dan tidak memerlukan manipulasi tambahan. Karena jumlah pengulangan tandem dalam galur yang berbeda dan di lokus yang berbeda berbeda, fragmen dengan ukuran yang berbeda ditentukan dan dianalisis pada elektroforegram produk PCR yang dihasilkan. Menurut para peneliti, dengan bantuan VNTR, tingkat diskriminasi galur yang lebih besar dicapai daripada dengan metode RFLP.

Banyak perhatian telah diberikan dalam beberapa tahun terakhir terhadap penyebaran strain Mycobacterium tuberculosis dari famili W-Beijing (kadang-kadang disebut strain Beijing), yang sebagian besar resistan terhadap obat.

Persyaratan dasar untuk kualitas penelitian biologi molekuler

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

Dokumen peraturan utama untuk melakukan PCR

Perintah Kementerian Kesehatan Federasi Rusia: No. 45 tanggal 7.02.2000; No. 109 tanggal 21.03.2003; No. 64 tanggal 21.02.2000. Pedoman: 1.3.1888-04 "Organisasi kerja selama penelitian PCR bahan yang terinfeksi agen biologis patogen dari kelompok patogenisitas III-IV"; 1.3.1794-03 "Organisasi kerja selama penelitian PCR bahan yang terinfeksi mikroorganisme dari kelompok patogenisitas I-II". 2003; 3.5.5.1034-01 "Disinfeksi bahan uji yang terinfeksi bakteri dari kelompok patogenisitas I-IV saat bekerja dengan metode PCR", 2001. Lampiran 11 pada Petunjuk tentang metode terpadu penelitian mikrobiologi dalam deteksi, diagnosis, dan pengobatan tuberkulosis.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

Staf

Penelitian biologi molekular dapat dilakukan oleh dokter diagnostik laboratorium klinik, ahli bakteriologi, ahli virologi, ahli biologi laboratorium diagnostik klinik, serta dokter spesialis dengan pendidikan kedokteran menengah yang telah menjalani spesialisasi dan pelatihan lanjutan sesuai dengan tata cara yang ditetapkan.

Penataan tempat laboratorium

Fasilitas laboratorium berikut diperlukan:

• Area pemrosesan sampel - laboratorium yang disesuaikan untuk bekerja dengan agen infeksius kelompok patogenisitas III-IV, sesuai dengan Pedoman Metodologi 13.1888-04.
• Area untuk menyiapkan campuran reaksi PCR adalah ruang laboratorium yang memberikan perlindungan dari kontaminasi laboratorium internal - area “bersih”.
• • Jika elektroforesis atau hibridisasi digunakan untuk menganalisis produk PCR, ruang laboratorium tempat fragmen DNA yang diamplifikasi diekstraksi dari tabung amplifikasi dan, karenanya, dapat memasuki lingkungan, sesuai dengan persyaratan untuk laboratorium PCR (Pedoman Metodologi 1.3.1794-03, Pedoman Metodologi 1.3.1888-04) harus sepenuhnya diisolasi dari ruangan yang ditentukan dalam paragraf sebelumnya. Pergerakan personel, peralatan, bahan, dan objek apa pun dari area elektroforesis ke area pemrosesan sampel dan area "bersih", serta perpindahan udara melalui sistem ventilasi atau akibat angin, harus dikecualikan. Area ini tidak diperlukan untuk deteksi fluorimetrik produk PCR.
• Ruang untuk dokumentasi dan pemrosesan hasil dilengkapi dengan komputer dan peralatan kantor yang diperlukan. Ruang ini dapat berisi peralatan yang memastikan deteksi produk PCR tanpa membuka tabung. - detektor PCR fluoresensi dan thermal cycler untuk PCR real-time.

Persyaratan sanitasi dan epidemiologi untuk pengolahan utama dahak serupa dengan persyaratan mikrobiologi standar untuk menangani Mycobacterium tuberculosis.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

Set lengkap peralatan laboratorium untuk diagnostik PCR

Peralatan laboratorium mencakup peralatan untuk ruangan berikut.

• ruang persiapan sampel, berisi peralatan berikut: kap aliran laminar kelas perlindungan II "SP-1.2": termostat solid-state dengan tutup yang dipanaskan untuk tabung reaksi Eppendorf; mikrocentrifuge pada 13.000 rpm; centrifuge ("Vortex"); lemari es dengan rentang suhu dari -20 ^° C hingga +10 ^° C; pipet volume variabel seri "Proline"; pompa dengan labu perangkap OM-1; rak pipet; rak stasiun kerja 200x0,5 ml; rak stasiun kerja 50x1,5 ml; rak untuk menyimpan tabung reaksi 80x1,5 ml;
• ruang persiapan campuran reaksi: kotak PCR ruang pelindung ("Laminar-C. 110 cm); centrifuge "Vortex"; pipet volume variabel seri "Proline"; rak pipet; rak stasiun kerja 200x0,2 ml; rak untuk menyimpan tabung reaksi 80x1,5 ml; lemari es dengan kisaran suhu dari -20 ^° C hingga +10 ^° C;
• Ruang elektroforesis: ruang elektroforesis horizontal; sumber daya; transilluminator;
• Penguat DNA atau penganalisa asam nukleat (PCR waktu nyata) dengan komputer dan perangkat lunak; dapat ditempatkan di ruangan mana pun yang tersedia. Jika menggunakan teknologi PCR waktu nyata, ruang elektroforesis tidak diperlukan.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

Kontrol kualitas eksternal

Untuk memastikan bahwa mereka memperoleh hasil yang dapat diandalkan secara objektif, laboratorium harus berpartisipasi dalam sistem penilaian eksternal terhadap kualitas penelitian laboratorium.

Peserta dalam sistem kendali mutu menerima: 12 ampul berisi suspensi beku-kering sel bakteri, dua di antaranya berisi E. coli, 3 ampul berisi mikobakteri tuberkulosis (strain avirulen) pada konsentrasi 10 ² /ml; 3 ampul berisi sel-sel dari strain yang sama pada konsentrasi 10 ⁴ /ml; masing-masing 2 ampul berisi mikobakteri non-tuberkulosis M. avium-intracellulare dan M. kansasii pada konsentrasi 10 ⁵ /ml.

Pengujian yang dikirim untuk penilaian mutu eksternal telah diuji terlebih dahulu di dua laboratorium independen yang mempunyai pengalaman luas di bidang ini.

[ 85 ], [ 86 ]