Metode genetika molekuler untuk mendiagnosis penyakit keturunan

Metode teknologi DNA digunakan untuk menentukan lokasi gen mutan dalam kromosom tertentu, yang bertanggung jawab atas asal-usul bentuk patologi herediter tertentu. Karena gen adalah bagian dari DNA, dan mutasi gen adalah kerusakan pada struktur primer DNA (mutasi dipahami sebagai semua perubahan dalam urutan DNA, terlepas dari lokasinya dan dampaknya terhadap kelangsungan hidup individu), maka, dengan memeriksa preparat kromosom metafase pasien dengan penyakit herediter, adalah mungkin untuk menetapkan lokasi gen patologis. Metode genetik molekuler menciptakan peluang untuk mendiagnosis penyakit pada tingkat struktur DNA yang berubah, metode ini memungkinkan kita untuk menentukan lokasi kelainan herediter. Metode genetik molekuler dapat mengidentifikasi mutasi yang terkait dengan penggantian bahkan satu basa tunggal.

Tahapan terpenting identifikasi gen adalah isolasinya. DNA dapat diisolasi dari semua jenis jaringan dan sel yang mengandung nukleus. Tahapan isolasi DNA meliputi: lisis sel secara cepat, penghilangan fragmen organel dan membran sel dengan sentrifugasi, penghancuran protein secara enzimatik dan ekstraksinya dari larutan menggunakan fenol dan kloroform, konsentrasi molekul DNA dengan presipitasi dalam etanol.

Di laboratorium genetika, DNA paling sering diisolasi dari leukosit darah, di mana 5-20 ml darah vena pasien diambil ke dalam tabung reaksi steril dengan larutan antikoagulan (heparin). Kemudian leukosit dipisahkan dan diproses sesuai dengan langkah-langkah di atas.

Tahap selanjutnya dalam mempersiapkan bahan untuk penelitian adalah "memotong" DNA menjadi fragmen-fragmen di area dengan urutan basa yang sangat spesifik, yang dilakukan dengan menggunakan enzim bakteri - endonuklease restriksi (enzim restriksi). Enzim restriksi mengenali urutan spesifik 4-6, lebih jarang 8-12 nukleotida dalam molekul DNA beruntai ganda dan membaginya menjadi fragmen-fragmen di lokasi urutan ini, yang disebut situs restriksi. Jumlah fragmen restriksi DNA yang dihasilkan ditentukan oleh frekuensi kemunculan situs restriksi, dan ukuran fragmen ditentukan oleh sifat distribusi situs-situs ini sepanjang molekul DNA asli. Semakin sering situs restriksi berada, semakin pendek fragmen DNA setelah restriksi. Saat ini, lebih dari 500 jenis enzim restriksi yang berasal dari bakteri diketahui, dan masing-masing enzim ini mengenali urutan nukleotida spesifiknya sendiri. Di masa depan, situs restriksi dapat digunakan sebagai penanda genetik DNA. Fragmen DNA yang terbentuk sebagai hasil restriksi dapat diurutkan berdasarkan panjangnya dengan elektroforesis dalam gel agarosa atau poliakrilamid, dan dengan demikian berat molekulnya dapat ditentukan. Biasanya, DNA dalam gel diidentifikasi dengan pewarnaan spesifik (biasanya etidium bromida) dan melihat gel dalam cahaya ultraviolet yang ditransmisikan. Tempat lokalisasi DNA diwarnai merah. Namun, pada manusia, ketika DNA diproses oleh beberapa enzim restriksi, begitu banyak fragmen dengan panjang yang berbeda terbentuk sehingga tidak dapat dipisahkan dengan elektroforesis, yaitu tidak mungkin untuk mengidentifikasi fragmen DNA individual secara visual pada elektroforesis (pewarnaan seragam diperoleh di sepanjang gel). Oleh karena itu, untuk mengidentifikasi fragmen DNA yang diinginkan dalam gel seperti itu, metode hibridisasi dengan probe DNA berlabel digunakan.

Setiap segmen untai tunggal DNA atau RNA mampu mengikat (hibridisasi) dengan untai komplementer, dengan guanin selalu mengikat sitosin, dan adenin mengikat timin. Beginilah cara molekul untai ganda terbentuk. Jika salinan untai tunggal gen kloning diberi label dengan label radioaktif, sebuah probe diperoleh. Probe tersebut mampu menemukan segmen DNA komplementer, yang kemudian mudah diidentifikasi menggunakan autoradiografi. Sebuah probe radioaktif yang ditambahkan ke preparasi kromosom yang diregangkan memungkinkan gen tersebut dilokalisasi pada kromosom tertentu: menggunakan probe DNA, area tertentu dapat diidentifikasi selama Southern blotting. Hibridisasi terjadi jika bagian DNA yang diuji mengandung gen normal. Dalam kasus di mana urutan nukleotida abnormal hadir, yaitu struktur kromosom yang sesuai mengandung gen mutan, hibridisasi tidak akan terjadi, yang memungkinkan lokalisasi gen patologis ditentukan.

Untuk memperoleh probe DNA, digunakan metode kloning gen. Inti dari metode ini adalah memasukkan fragmen DNA yang sesuai dengan gen atau bagian gen ke dalam partikel kloning, biasanya plasmid bakteri (DNA ekstrakromosomal annular yang terdapat dalam sel bakteri dan membawa gen resistensi antibiotik), kemudian bakteri dengan plasmid yang disisipkan gen manusia tersebut diperbanyak. Berkat proses sintesis dalam plasmid, miliaran salinan gen manusia atau bagiannya dapat diperoleh.

Salinan DNA yang dihasilkan, diberi label dengan label radioaktif atau fluorokrom, kemudian digunakan sebagai penyelidikan untuk mencari urutan komplementer di antara kumpulan molekul DNA yang dipelajari.

Saat ini, ada banyak jenis metode berbeda yang menggunakan pemeriksaan DNA untuk mendiagnosis mutasi gen.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]